استخراج DNA چیست؟

به عبارت ساده، استخراج DNA حذف دئوکسی‌ریبونوکلئیک‌ اسید (DNA) از سلول‌ها یا ویروس‌هایی است که معمولا در آن‌ها وجود دارد. استخراج DNA اغلب یک مرحله‌ی اولیه در بسیاری از فرآیندهای تشخیصی است که برای شناسایی باکتری‌ها و ویروس‌ها در محیط و همچنین تشخیص بیماری‌ها و اختلالات ژنتیکی استفاده می‌شود. این تکنیک‌ها شامل هیبریداسیون درجا فلورسانس (FISH) است، اما محدود به آن نمی‌شود.

تاریخچه استخراج DNA

برای اولین‌بار DNA در دهه1869 توسط یک پزشک سوئیسی به نام «فردیش میشر» که روی یک پروژه تحقیقاتی تعیین ترکیب شیمیایی سلول کار می‌کرد، شناسایی شد. او هنگامی که  روی لکوسیت‌ها (گلبول‌های سفید) کار می‌کرد، متوجه‌ی رسوب ماده‌ای در هنگام افزودن اسید شد که به‌دنبال افزودن یک ماده‌ی قلیایی از بین می‌رفت؛ میشر، این ماده را «نوکلئین» نامید و متوجه شد که ترکیب شیمیایی این ماده با پروتئین‌ها و سایر مولکول‌های شناخته‌شده متفاوت است و حدس زد که نقش اصلی در سلول‌ها و تقسیم سلولی را بر عهده دارد.

از زمان میشر تاکنون پیشرفت‌های زیادی در روش‌های استخراج و خالص‌سازی DNA رخ داده‌است. از سال 1950 تا همین اواخر استخراج DNA متکی بر استفاده از سانتریفیوژهای گرادیان چگالی بود. روش‌های قدیمی استخراج، پیچیده و زمان‌بر بودند و تنها مقادیر کمی از DNA را ارائه می‌کردند. اما امروزه روش‌های استخراج تخصصی زیادی وجود دارند که مبتنی بر راه‌حل هستند. استخراج دی ان ای با ظهور کیت‌های تجاری و اتوماسیون فرایند بسیار آسان‌تر شده‌است و باعث تسریع و افزایش تولید DNA شده‌است.

کاربرد استخراج DNA

استخراج و خالص‌سازی DNA نیز برای تعیین ویژگی‌های منحصربه‌فرد DNA ازجمله اندازه، شکل و عملکرد آن و همچنین تعیین توالی ژنوم‌ها، شناسایی باکتری‌ها و ویروس‌ها در محیط، تعیین پدر و مادر و پزشکی‌ قانونی ضروری است.

• پزشکی قانونی: تیم‌های پزشکی قانونی اغلب از DNA، برای تعیین و تشخیص مضنون‌بودن و یا حذف یک مضنون استفاده می‌کنند. DNA، گاهی اوقات می‌تواند بی‌گناهی یا گناه یک فرد را ثابت کند.
• تست‌های پدری: استخراج DNA می‌توانند والدین یک کودک را مشخص کند. برای نمونه اگر فردی ادعای پدربودن و یا بالعکس را داشته باشد، با انجام آزمایش DNA می‌توان ادعای آن را تأیید یا رد کرد.
• ردیابی اجداد: استخراج دی ان ای، علاوه بر اینکه به افراد کمک می‌کند تا اجداد خود را بشناسند، به آن‌ها کمک می‌کند تا با کیت‌های DNA مدرن، مکان‌هایی که اجدادشان از آنجا آمده‌اند و همه کشورهایی را که پدر و مادرش اهل آنجا هستند را بشناسند.
• آزمایش‌های پزشکی: برای برخی از شرایط پزشکی به‌ویژه اگر شرایط پزشکی ژنتیکی باشد، استخراج DNA، برای تشخیص بیماری ضروری است. مانند بیماری‌های «فیبروز کیستیک»، «هانتینگتون» و «سندروم داون».
• مهندسی ژنتیک: استخراج DNA، برای مهندسی ژنتیک گیاهان و حیوانات بسیار باارزش است. از این تکنیک در گیاهان برای شناسایی، جداسازی و استخراج ژن مورد نظر برای تکثیر در نسل‌های متوالی گیاهان و در حیوانات برای شبیه‌سازی حیوانات و انتقال DNA یک حیوان به حیوان دیگر استفاده می‌شود.

از تکنیک استخراج DNA همچنین در ساخت واکسن‌ها و توسعه برخی هورمون‌ها مانند هورمون‌های رشد انسانی و انسولین استفاده می‌شود.

---

همچنین بخوانید: اسپور چیست؟

---

کارکرد استخراج دی ان ای:

• شکستن سلول‌ها برای آزادسازی DNA: سلول‌های موجود در یک نمونه، اغلب با ابزارهای فیزیکی مانند آسیاب‌کردن، از یکدیگر جدا می‌‌شوند و در محلول حاوی نمک قرار می‌گیرند. یون‌های سدیم با بار مثبت در نمک به محافظت از گروه‌های فسفات با بار منفی که در امتداد ستون فقرات DNA قرار دارند، کمک می‌کند. سپس یک ماده شوینده اضافه می‌شود. مواد شوینده لیپیدهای غشای سلولی و هسته را تجزیه می‌کنند.  با مختل‌شدن این غشاها DNA آزاد می‌شود.
• جداسازی DNA از پروتئین‌ها و سایر بقایای سلولی: برای به‌دست‌آوردن یک نمونه تمیز از DNA، لازم است تا جایی که ممکن است بقایای سلولی حذف شوند. این کار را می‌توان با روش‌های مختلفی انجام داد. اغلب یک پروتئاز (آنزیم پروتئینی) برای تجزیه پروتئین‌های مرتبط با DNA و سایر پروتئین‌های سلولی اضافه می‌شود.  از طرف دیگر، برخی از بقایای سلولی را می‌توان با فیلترکردن نمونه حذف کرد.
• رسوب DNA با الکل: در نهایت، الکل یخی (اعم از اتانول یا ایزوپروپانول) با دقت به نمونه DNA اضافه می‌شود. DNA در آب محلول است اما در حضور نمک و الکل نامحلول است. با هم‌زدن ملایم لایه الکل با یک پیپت استریل، یک رسوب قابل رویت ایجاد می‌شود و می‌توان آن را بیرون ریخت. اگر تعداد زیادی DNA وجود داشته باشد، ممکن است یک رسوب رشته‌ای و سفید رنگ مشاهده شود.
• پاک‌سازی DNA: نمونه DNA اکنون می‌تواند بیشتر خالص شود (شست‌وشو و تمیز شود). سپس در یک بافر کمی قلیایی معلق می‌شود و آماده استفاده است.
• تایید وجود و کیفیت DNA: برای کارهای آزمایشگاهی بیشتر دانستن غلظت و کیفیت DNA مهم است.  خوانش چگالی نوری که توسط «اسپکتروفتومتر» گرفته می‌شود، می‌تواند برای تعیین غلظت و خلوص DNA در یک نمونه استفاده شود. روش دیگر، الکتروفورز ژل می‌تواند برای نشان‌دادن حضور DNA  در نمونه شما و نشان‌دادن کیفیت آن استفاده شود.

انواع مختلف روش‌های استخراج  DNA

بسته به نوع نمونه، هر روش استخراج DNA متفاوت است. به‌عنوان مثال، روش استخراج DNA برای DNA گیاه با روش استخراج آن از خون متفاوت است.  به همین ترتیب، روش جداسازی DNA باکتری با انواع دیگر متفاوت است. بنابراین، انواع روش‌ های استخراج DNA برای نمونه‌های مختلف وجود دارد. روش‌های استخراج DNA به‌طور کلی به دودسته تقسیم می‌شوند که عبارت‌اند از:

• روش‌های استخراج DNA مبتنی بر محلول (شیمیایی)

روش شیمیایی یا مبتنی‌بر محلول از بسیاری از محلول‌های آلی و غیر آلی استفاده می‌کند.

• استخراج DNA مبتنی‌بر حلال آلی

این روش به استفاده از مواد آلی مانند فنل و کلروفرم بستگی دارد.

مانند: «فنل»، «کلروفرم» و «ایزوآمیل الکل».

• استخراج DNA مبتنی‌بر حلال غیرآلی

این روش به حلال‌های معدنی استفاده بستگی دارد.

مانند: «استخراج DNA پروتئیناز K»، «روش نمک‌‌زدن»، استخراج “DNA SDS”، استخراج “DNA CTAB”، «تکنیک‌های مبتنی‌بر ژل سیلیکا».

• روش‌های استخراج DNA مبتنی‌بر فاز جامد (روش فیزیکی)

روش‌ مبتنی‌بر فاز جامد شامل:

• استخراج DNA از کاغذ
• استخراج DNA از مهره‌های مغناطیسی

استخراج DNA مایع-مایع

استخراج مایع-مایع یکی از رایج‌ترین روش‌ها برای استخراج اسیدنوکلئیک است. در این روش از محلول‌های تهیه شده با ترکیبات شیمیایی مختلف برای استخراج استفاده می‌شود و عمدتاً متکی بر تهیه بافر لیز است. مواد شیمیایی رایجی که برای استخراج DNA مایع-مایع استفاده می‌شوند عبارت‌اند از: فنل، کلروفرم، ایزوآمیل الکل، “CTAB”، “SDS”، “Tris”، “EDTA”، “MgCl₂” و سایر مواد شوینده. این روش‌ها معمولاً برای جداسازی نیاز به سانتریفیوژ دارند.

| صفر تا صد استخراج DNA از خون

مقایسه روش‌های استخراج DNA

روش فنل-کلروفرم

در این روش می‌توان DNA را براساس حلالیت مولکول‌های DNA در محلول‌های غیرقابل اختلاط جدا کرد که به آن روش‌های استخراج DNA مایع- مایع می‌گویند (روش استخراج DNA با کلروفرم فنل یکی از این روش‌ها است). اگرچه این روش یکی از بهترین روش‌ها محسوب می‌شود، اما به‌دلیل مضر‌بودن فنل و کلروفرم کمتر توصیه می‌شود. کمیت و کیفیت DNA به‌دست‌آمده با این روش بسیار خوب است. این روش به روش فنل-کلروفرم و ایزوآمیل الکل یا روش استخراج DNA PCI معروف است. جزء ارگانیک این تکنیک یعنی  فنل و کلروفرم بخش پروتئین سلول‌ها را دناتوره می‌کنند و اجزای بافر لیز به غشای سلولی و لیز هسته‌ای کمک می‌کنند. در اصل، فنل پروتئین‌ها را هضم می‌کند و ایزوآمیل الکل اسیدنوکلئیک را جدا می‌کند.

مزیت اصلی PCI این است که می‌تواند DNA را تقریباً از همه انواع بافت جدا کند (برای سلول‌های حیوانی، گیاهی و باکتریایی کاربرد دارد) و همچنین می‌تواند RNA را در صورت استفاده از «گوانیدین تیوسیانات» جدا کند. بدون شک، این روش ناایمن است زیرا فنل فرار است و می‌تواند باعث سوختگی شود.

مزایا

• بازده بالای DNA
• مناسب برای طیف وسیعی از انواع نمونه
• قابل استفاده برای قطعات کوچک و بزرگ DNA

معایب

• زمان‌بر و کار فشرده
• به مواد شیمیایی خطرناک نیاز دارد
• خطر تخریب  DNA

استخراج “Chelex“

این روش شامل استفاده از رزینی به نام Chelex است که به یون‌های فلزی متصل می‌شود که می‌تواند از تقویت DNA جلوگیری کند.  Chelex  به نمونه اضافه می‌شود و مخلوط حرارت داده می‌شود تا DNA آزاد شود.

مزایا

• سریع و آسان
• به حداقل آماده‌سازی نمونه نیاز دارد
• مناسب برای استخراج در مقیاس کوچک

معایب

• بازده کمتر DNA نسبت به روش‌های دیگر
• ممکن است برای نمونه‌های پیچیده مناسب نباشد
• می‌تواند منجر به این شود که  DNA ناخالص شود

استخراج “Magnetic bead“

در این روش از دانه‌های مغناطیسی پوشیده شده با یک ماده متصل‌کننده به DNA برای جداسازی DNA از نمونه استفاده می‌شود.

مزایا

• بازده بالای DNA خالص
• سازگار با اتوماسیون و برنامه‌های کاربردی با توان بالا
• قابل استفاده برای طیف گسترده‌ای از انواع نمونه

 معایب

• تجهیزات و معرف‌های گران قیمت
• خطر انتقال مهره از یک نمونه به نمونه دیگر
• ممکن است برای هر نوع نمونه نیاز به بهینه‌سازی داشته باشد

استخراج “Spin column“

در این روش از ستونی پر شده با رزین استفاده می‌شود که به طور خاص DNA را متصل می‌کند.

مزایا

• بازده بالای DNA خالص
• سازگار با اتوماسیون و برنامه‌های کاربردی با توان بالا
• قابل استفاده برای طیف گسترده‌ای از انواع نمونه

معایب

• تجهیزات و معرف‌های گران‌قیمت
• برای جلوگیری از تخریب DNA نیاز به رسیدگی دقیق دارد
• ممکن است برای هر نوع نمونه نیاز به بهینه‌سازی داشته باشد

استخراج DNA پروتئیناز K

روش مبتنی‌بر پروتئیناز K یکی از روش‌های مبتنی‌بر محلول معدنی برای استخراج DNA است. روش استخراج DNA پروتئيناز K مقدار زيادي DNA را فراهم مي‌كند، اما عيب اين روش اين است كه زمان زيادي مي‌برد. همچنین در صورت عدم حفظ آنزیم در زنجیره سرد، نمی‌توان از آنزیم پروتئیناز K برای مدت زمان طولانی‌تری استفاده کرد. مشکل اصلی دیگر این است که پایداری آنزیم پایین است.

استخراج DNA نمکی

روش استخراج “DNA Salting-out Extraction” یک تکنیک ساده و غیرسمی است که DNA را با کیفیت بالا از خون کامل جدا می‌کند. این روش ایمن‌تر از روش فنل-کلروفرم بوده و بستگی به استفاده از نمک‌هایی مانند استات پتاسیم، کلرید سدیم و استات آمونیوم دارد که به استخراج DNA کمک می‌کنند. همچنین این روش در ترکیب با پروتئیناز K نتایج عالی می‌دهد و می‌توان عملکرد کافی را به‌دست آورد اما کیفیت (خلوص) به‌دست آمده ممکن است خوب نباشد.

مزایا

• هزینه کم و پروتکل ساده
• مناسب برای استخراج در مقیاس بزرگ
• قابل استفاده برای طیف گسترده‌ای از انواع نمونه

معایب

• بازده کمتر DNA نسبت به روش‌های دیگر
• نیاز به بهینه‌سازی غلظت نمک برای هر نوع نمونه
• خطر تخریب  DNA

استخراج “DNA SDS”

SDS یا سدیم دودسیل سولفات یک شوینده آنیونی است که پروتئین‌های هسته و غشای سلولی را هضم می‌کند.  SDS به هر پروتئین بر حسب اندازه آن‌ها بار منفی می‌دهد. ازآن‌جایی‌که همه پروتئین‌ها در جداسازی ژل شکل یکسانی دارند، فقط به دلیل اندازه از هم جدا می‌شوند. بنابراین، SDS می‌تواند برای کمک به لیزکردن سلول در طول استخراج DNA استفاده شود.

استخراج “DNA CTAB”

“CTAB” یا “Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide” یک ماده شیمیایی است که اغلب در استخراج DNA استفاده می‌شود. این روش یک روش استخراج مایع-مایع و بر پایه محلول برای استخراج DNA گیاه است. بافر CTAB پلی‌ساکاریدها و پلی‌فنل‌ها را به‌طور موثر حذف می‌کند و عملکرد عالی برای DNA گیاه دارد. این روش به آماده‌سازی شیمیایی گسترده و تکنیک‌های اضافی مانند همگن‌سازی بافت و استفاده از نیتروژن مایع نیاز دارد. همچنین زمان زیادی می‌برد.

مزایا

• مناسب برای نمونه‌هایی با سطوح بالای آلاینده
• قابل استفاده برای طیف گسترده‌ای از انواع نمونه
• بازده بالای DNA

معایب

• به مواد شیمیایی خطرناک نیاز دارد
• زمان‌بر و کار فشرده
• ممکن است منجر به این شود که DNA ناخالص شود

تکنیک‌های مبتنی‌بر ژل سیلیکا

در تکنیک استخراج DNA با ستون چرخشی، سیلیکاژل به‌عنوان یک فاز جامد در یک لوله بی‌حرکت می‌شود. یک بافر لیز تهیه‌شده مخصوص برای هضم نمونه استفاده شده و به آن اجازه می‌دهد تا در فاز جامد جدا شود. نمونه ابتدا سانتریفیوژ می‌شود تا با محافظت از DNA و تغییر pH محلول (برای شست‌وشوی DNA در مرحله آخر) تمام باقی‌مانده‌ها حذف شود. این تکنیک‌ها اکنون به صورت تجاری در دسترس هستند. ستون چرخش پیشرفته‌ترین، موثرترین، سریع‌ترین و دقیق‌ترین تکنیک جداسازی است. با این حال، این یک روش شیمیایی برای استخراج DNA بوده که براساس اصل جداسازی فاز جامد کار می‌کند. مزیت اصلی این تکنیک این است که می‌تواند DNA را از هر نمونه و بافت بیولوژیکی جدا کند. ازاین‌رو، جداسازی DNA از گیاهان حتی با استفاده از تکنیک ستون چرخشی دشوار است، اکنون ستون‌های مختلف بسته به نوع نمونه در دسترس هستند. به همه این‌ها این تکنیک Cost بوده، فاقد بهینه‌سازی است و بازده به‌نسبت پایین اما خوبی دارد. 

جمع‌بندی

استخراج DNA‌، برای بیوتکنولوژی بسیار مهم است و نقطه‌ی شروع برای کاربردهای متعددی همچون تحقیقات بنیادی، تصمیم‌گیری‌های تشخیصی و درمانی است. توانایی استخراج DNA برای مطالعه علل ژنتیکی بیماری، توسعه تشخیص‌ها و داروها از اهمیت اولیه برخوردار است.

نویسندگان: یاسمن اسمی، کوثر حاجی‌پور

منابع:

1. https://www.sciencelearn.org.nz/resources/2036-dna-extraction
2. https://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/genomics/dnaext.html
3. https://whatisbiotechnology.org/index.php/science/summary/extraction/dna-extraction-isolates-dna-form-biological-material
4. https://www.revsci.com/blogs/biotechnology/common-uses-for-dna-extraction

تهیـه‌شـده در آکـــادمـی ژنـــتیـــک ایــران