تکنیک های آزمایشگاهی

استخراج DNA به روش رسوب دهی نمک (salting out)

آشنایی با ساختار DNA

DNA ( دئوکسی ریبونوکلئیک اسید) ماده وراثتی در انسان ها و تقریبا تمامی ارگانیسم ها می باشد. DNA،  دو رشته ای  میباشد که شامل چهار باز آلی به نام (آدنین A ، سیتوزین C ، گوانین G و تیمین T) است  که ترتیب و توالی این بازها اطلاعات موجود در DNA را می سازند. باز های موجود در دو رشته DNA با هم جفت شده اند تا واحدهایی به نام جفت باز را بسازند. هر باز به یک قند و یک مولکول فسفات اتصال می یابد و ساختار یک باز، یک قند و یک فسفات باهم یک نوکلئوتید را می سازد.

ساختار DNA دو رشته ای

استخراج DNA به چه صورت انجام میگیرد؟

در بخش استخراج DNA با تلفیقی از روش های فیزیکی و شیمیایی، DNA از نمونه ها استخراج میگردد. اسید های نوکلئیک به عنوان اولین مرحله در تحقیقات و بررسی های ژنتیکی برای مطالعه علت ژنتیکی بیماری ها، تعیین توالی ژنوم و انجام آزمایشات پدری و مادری (پزشکی قانونی) دارای اهمیت است. بیشترین ماده مورد استفاده در این آزمایش خون میباشد و حتما باید دارای ماده ضد انعقاد EDTA و  یا سیترات باشد. تاکنون مطالعات متعددی برای پیدا کردن روش مناسب استخراج از نمونه هایی مانند بافت ، اسلاید های خون محیطی و مغز استخوان و حتی از تک سلول انجام شده است.

نمونه خون برای استخراج DNA

مراحل استخراج DNA به روش رسوب دهی نمک

  1. یکی از روش های متداول برای استخراج DNA استفاده از نمک های اشباع می باشد:

همه سلول های دارای هسته DNA دارند؛ بنابراين، در بافت هایی مثل خون فقط گلبول هاي سفيد DNA دارند و گلبول های قرمز DNA ندارند، پس در ابتدا باید از شر گلبول های قرمز خلاص شوید.

روش جداسازی گلبول های قرمز از خون:

به این منظور، مقداری خون را در تیوب ریخته و  تقریبا دو برابر حجم خون آب مقطر سرد به آن اضافه نمایید. پدیده اسمز در گلبول‌های قرمز  باعث می شود مولکول‌های آب از جداره ی نیمه تراوای گلبول قرمز عبور کرده و به درون گلبول قرمز راه ‌یابند، در نتیجه مقدار آب درون گلبول رفته رفته افزایش یافته، تورژسانس رخ می دهد و منجر به پاره شدن جداره ی سلول خونی و لیز آن می شود. در این مرحله می توان به جای آب مقطر سرد از بافر لیز کننده گلبول قرمز شامل NH۴Cl، KHCO۳ Naو   EDTAهمراه با Triton X100 نیز استفاده کرد  تا نتیجه بهتری گرفت. بعد از ۱۰ الی ۱۵ دقیقه شوک حرارتی و هم چنان تکان دادن پیاپی میکروتیوب، آن را سانتریفوژ نمایید. این مرحله را تا زمان بی رنگ شدن رسوب و عدم مشاهده رنگ قرمز تکرار نمایید (حداقل دو تا سه مرتبه).

          2. محلول رویی را دور ریخته و بر روی رسوب، بافر لیز کننده هسته بریزید و با پیپتاژ رسوب را حل کنید.

استفاده از SDS  برای تخریب پروتئین ها:

          3.در ادامه SDS 10% به محلول فوق اضافه کرده در دمای ۵۶ الی ۶۵ به مدت ۳ الی ۱۶ ساعت به صورت بهینه موجب تخریب پروتئین­ها و همچنین unfold شدن آن­ها می­ شود.

          4. در مرحله بعد Nacl اشباع به میکروتیوب واقع بر یخ اضافه کنید و ۵ دقیقه بر روی یخ انکوبه نمایید، چندین مرتبه shake کرده و سپس  سانتریفوژ نمایید تا پروتئین ها رسوب کند.

          5.سوپرناتانت را به میکروتیوب جدیدی منتقل نموده و بر روی آن هم حجم سوپرناتانت، ایزوپروپانل ( و یا دو برابر حجم اتانول مطلق) سرد بریزید. ابتدا آهسته و سپس سریع تکان دهید تا کلاف DNA ظاهر شود و چند دقیقه در دمای  -۲۰ درجه انکوبه نمایید، سپس سانتریفوژ کنید تا کلاف DNA رسوب نماید.

          6.محلول رویی را تخلیه کرده و رسوب را در اتانول ۷۵% حل نمایید. چندین مرتبه میکروتیوب را invert کرده و سپس سانتریفوژ نمایید، محلول رویی را خارج کرده و تیوب را در محیط آزمایشگاه و یا برای سرعت عمل بیشتر در دمای ۵۶ درجه سانتیگراد قرار دهید تا خشک شود

           7.با توجه به اندازه کلاف تشکیل شده مقداری TE یا ddH2O  به آن اضافه کنید و در ادامه تیوب را به مدت ۱۵-۲۰ دقیقه در محیط آزمایشگاه قرار دهید تا رسوب حل شود و در نهایت به فریزر منتقل نمایید.

منابع:

  1. http://zeinalislab.ir/page.php?slct_pg_id=119&sid=1&slc_lang=fa
  2. https://www.geniranlab.ir/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D8%B1%D8%A7%D8%AC-dna
  3. http://darwino.ir/extraction-of-dna-from-blood-by-salting-out-method/

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا