PCR چیست؟

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase chain reaction) یا به اختصار «PCR» یک تکنیک آزمایشگاهی برای تکثیر سریع میلیون‌ها تا میلیاردها نسخه از یک بخش خاص از DNA است که می‌تواند با جزئیات بیشتری مورد مطالعه قرار گیرد. تکنیک PCR در بسیاری از زمینه‌های زیست‌شناسی و پزشکی از جمله تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی، تشخیص پزشکی و حتی برخی از شاخه‌های اکولوژی استفاده می‌شود. برای انجام این واکنش از دستگاهی به‌نام ترموسایکلر استفاده می‌شود. ترموسایکلرها ابزارهایی هستند که برای تکثیر نمونه‌های DNA و RNA توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز استفاده می‌شوند. ترموسایکلر دمای نمونه‌ها را در یک بلوک نگهدارنده در مراحل گسسته و از پیش برنامه‌ریزی‌شده افزایش و کاهش می‌دهد و امکان دناتوره شدن نمونه‌ها با معرف‌های مختلف را فراهم می‌کند.

در تکنیک PCR، واکنش به‌طور مکرر از طریق یک سری تغییرات دما می‌چرخد که اجازه می‌دهد نسخه‌های زیادی از منطقه هدف تکثیر شود.  PCR کاربردهای تحقیقاتی و عملی زیادی دارد.  این تکنیک به‌طور معمول در شبیه‌ساز DNA، تشخیص پزشکی و تجزیه و تحلیل پزشکی قانونی DNA استفاده می‌شود. به‌طور معمول، هدف PCR ساختن مقدار کافی از ناحیه DNA هدف است که بتوان آن را آنالیز کرد یا به روش دیگری استفاده کرد. به‌عنوان مثال، DNA تکثیرشده توسط PCR ممکن است برای تعیین توالی فرستاده شود، روی ژل الکتروفورز برد، یا برای آزمایش‌های بیشتر در پلاسمید کلون شود.

تاریخچه

تکنیک PCR همانطور که امروزه می‌شناسیم در دهه 1980 توسط کری مولیس و همکارانش در شرکت Cetus مفهوم‌سازی و توسعه یافت. جداسازی و خالص‌سازی پلیمرازهای Taq پایدار در برابر حرارت منجربه اتوماسیون تکنیک PCR در ابتدا آهسته و پر زحمت شد و توسعه چرخه‌های حرارتی قابل برنامه‌ریزی PCR، آن را به روشی گسترده در بسیاری از سطوح زیست‌شناسی و شیمی تبدیل کرد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) در ابتدا در سال 1983 توسط بیوشیمیدان آمریکایی کری مولیس توسعه یافت. او در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را به خاطر کارهای پیشگامانه خود دریافت کرد. مولیس همراه با مایکل اسمیت در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را جهت کار روی PCR دریافت کردند. اگرچه مولیس PCR را اختراع کرد، اما کاربردهای موفقیت‌آمیز آن در چندین زمینه نتیجه کار سخت دیگر محققان مانند Henry Erlich است. همچنین، اختراعات PCR که توسط Mullis براساس تحقیقات اولیه توسط Khorana و همکاران انجام شده چالش‌هایی در دهه 1960 و 1970 وجود دارد. در دسامبر 1989، Taq Polymerase  توسط مجله Science به‌عنوان «مولکول سال» انتخاب شد. مقاله Taq PCR بعدا به پر استنادترین مقاله در زیست‌شناسی تبدیل شد و PCR بیش از 3 درصد از کل استنادها در PubMed را به خود اختصاص داد.

اجزای  PCR

• DNA الگو: DNA نمونه‌ای است که حاوی توالی هدف است. در ابتدای واکنش، دمای بالا به مولکول DNA  دو رشته‌ای اصلی اعمال می‌شود تا رشته‌ها از آن جدا شوند.
• DNA پلیمراز: مانند تکثیر DNA در ارگانیسم، PCR نیز به یک آنزیم DNA پلیمراز نیاز دارد که رشته‌های جدیدی از DNA را با استفاده از رشته‌های موجود به‌عنوان الگو می‌سازد. DNA  پلیمرازی که معمولا در PCR استفاده می‌شود، Taq polymerase  نامیده می‌شود که به‌نام باکتری مقاوم به حرارت که از آن جدا شده‌است (Thermus aquaticus) نامیده می‌شود. aquaticus  در چشمه‌های آب گرم و دریچه‌های هیدروترمال زندگی می‌کند. DNA  پلیمراز در برابر حرارت بسیار پایدار است و در حدود 70 درجه سانتیگراد فعال است. این پایداری حرارتی Taq پلیمراز را برای PCR ایده‌آل می‌کند.
• پرایمر: مانند سایر DNA پلیمرازها، Taq polymerase تنها زمانی می‌تواند DNA بسازد که به آن یک آغازگر داده شود، توالی کوتاهی از نوکلئوتیدها که نقطه شروعی برای سنتز DNA است. پرایمرهای PCR قطعات کوتاهی از DNA تک‌رشته‌ای هستند که معمولا حدود 20 نوکلئوتید طول دارند. در هر واکنش PCR از دو پرایمر استفاده می‌شود و به گونه‌ای طراحی شده‌اند که ناحیه مورد نظر (منطقه‌ای که باید کپی شود) کنار هم قرار گیرند. به این معنی که توالی‌هایی به آن‌ها داده می‌شود که آن‌ها را به رشته‌های مخالف DNA الگو، درست در لبه‌های ناحیه ای که قرار است کپی شود، متصل می‌کند. پرایمرها با جفت شدن پایه مکمل به الگو متصل می‌شوند. هنگامی که پرایمرها به قالب متصل می‌شوند، می‌توان آن‌ها را توسط پلیمراز گسترش داد و ناحیه ای که بین آن‌ها قرار دارد کپی می‌شود.
• نوکلئوتیدها (dNTPs) یا دئوکسی نوکلئوتید تری ‌فسفات: بازهای DNA (A,T,C,G) بلوک‌های سازنده DNA هستند و برای ساخت رشته جدید DNA مورد نیاز هستند.
• بافر: برای اطمینان از شرایط مناسب برای واکنش.

همچنین بخوانید: استخراج DNA

مراحل تکنیک PCR

• Denaturing stage یا مرحله دناتوره:

در این مرحله مخلوطی حاوی DNA الگو و سایر اجزای اصلی تا دمای 94-95 درجه سانتی گراد گرم می‌شود. دمای بالا باعث می‌شود پیوندهای هیدروژنی بین بازهای هر دو رشته DNA الگو شکسته شود و دو رشته جدا شوند. شکسته شدن پیوندهای هیدروژنی و باز شدن رشته‌ها باعث می‌شود که دو رشته منفرد DNAالگو، هرکدام به عنوان الگویی برای ساخت رشته‌های جدید DNA مورد استفاده قرار گیرد.

باید توجه داشت که در این مرحله دما برای طولانی مدت حفظ شود تا رشته‌های DNAبه صورت کامل از هم جدا شوند. این زمان معمولا بین 15-30 ثانیه طول می‌کشد.

• Annealing stage:

در این مرحله واکنش، دما را تا دمای 50-65 درجه سانتیگراد سرد کاهش می‌دهند.  اینکار باعث می‌شود پرایمرها از طریق پیوند هیدروژنی به یک مکان خاص روی DNA الگوی تک رشته‌ای متصل شوند (دمای دقیق بستگی به دمای ذوب پرایمرهایی دارد که استفاده می‌شود)

پرایمر (primer)، یک نوع رشته ژنتیکی کوتاه است که به عنوان الگویی برای شروع فرایند تکثیر و تولید کپی‌های جدید DNA یا RNA استفاده می‌شود. پرایمرها به عنوان نوکلئوتیدهای کوتاه با طول حدود 18-24 نوکلئوتید، با الگوی مشخصی برای هر قطعه DNA یا RNA طراحی می‌شوند تا به مکان دقیقی در رشته هدف متصل شوند و به عنوان نقطه شروع برای تکثیر و تولید کپی‌های جدید از رشته مورد نظر، عمل کنند.

زمانی که پرایمر متصل شد، آنزیم پلیمراز می‌تواند متصل شود و شروع به ساخت رشته مکمل جدید DNA از بازهای سست DNA کند. دو رشته جدا شده از DNA مکمل یکدیگر هستند و در جهت مخالف قرار دارند (از یک انتها – انتهای `5 –  به سمت دیگر – انتهای `3) در نتیجه، دو آغازگر وجود دارد – یک پرایمر جلو و یک آغازگر معکوس، این مرحله معمولاً حدود 10-30 ثانیه طول می‌کشد.

• Extending stage:

در مرحله آخر، گرما به 27C افزایش می‌یابد تا DNA جدید توسط آنزیم DNA Taq پلیمراز ویژه ساخته شود که بازهای DNA را اضافه می‌کند.

DNA Taq پلیمراز آنزیمی است که از باکتری‌های گرما دوست ترموس آبی Thermus aquaticus  گرفته شده است. این باکتری به طور معمول در چشمه های آب گرم زندگی می‌کند، بنابراین می‌تواند دمای بالای 80 درجه سانتیگراد را تحمل کند.

DNA پلیمراز باکتری در دماهای بالا بسیار پایدار است، به این معنی که می تواند دمای مورد نیاز برای شکستن رشته های DNA را در مرحله دناتوره شدن PCR تحمل کند.

72درجه سانتی گراد دمای بهینه برای Taq polymerase است که رشته مکمل را بسازد. Taq polymerase به پرایمر متصل می‌شود و سپس بازهای DNA را یک به یک در جهت 5`به 3` به تک رشته اضافه می‌کند. در نتیجه یک رشته کاملا جدید از DNA و یک مولکول دو رشته ای DNA است. مدت زمان این مرحله به طول توالی DNA معمولا حدود یک دقیقه طول می کشد تا 1000 بازDNA (1Kb) کپی شود.

این سه فرآیند چرخه حرارتی 20-40 بار تکرار می شوند تا تعداد زیادی کپی از توالی DNA مورد نظر تولید شود. قطعات جدید DNA که در طی PCR ساخته می‌شوند به عنوان الگوهایی عمل می‌کنند که آنزیم DNA پلیمراز می‌تواند به آن متصل شود و شروع به ساخت DNA کند. بنابراین تعداد زیادی کپی از بخش خاصی از DNA در مدت زمان نسبتا کوتاهی تولید می‌شود.

انواع PCR و کاربردهای آن

• “Real-Time PCR” (PCR کمی یا qPCR): که در آن مولکول‌های DNA با استفاده از رنگ فلورسنت برچسب‌گذاری می‌شوند، که برای نظارت و تعیین کمیت محصولات PCR در زمان واقعی استفاده می‌شود.
• Reverse-Transcriptase” (RT-PCR)”: دی‌ان‌ای مکمل (cDNA) را با رونویسی معکوس RNA به DNA با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس ایجاد می‌کند.
• “Multiplex PCR”: از تعدادی آغازگر برای تکثیر چند قطعه در یک نمونه DNA استفاده می‌کند.
• “Nested PCR”: پس از 25-35 چرخه اولیه PCR، یک PCR اضافی با استفاده از پرایمرهای جدید در پرایمرهای اصلی انجام می‌شود که خطر محصولات ناخواسته را کاهش می‌دهد.
• “Hot Start PCR”: که در آن از گرما برای دناتوره‌ کردن آنتی‌بادی‌هایی به کار گرفته می‌شود که برای غیر فعال کردن Taq پلیمراز استفاده می‌شود.
• “Long-range PCR”: محدوده طولانی‌تری از DNA با استفاده از مخلوطی از پلیمرازها تشکیل می‌شود.
• “Assembly PCR”: قطعات DNA بلندتر با استفاده از آغازگرهای همپوشانی تکثیر می‌شوند.
• “Asymmetric PCR”: تنها یک رشته از DNA هدف تکثیر می‌شود.
• “In situ PCR”: پی‌سی‌آر که در سلول‌ها یا در بافت ثابت روی یک اسلاید انجام می‌شود.

همچنین بخوانید: هیبریدسازی اسید نوکلئیک

استفاده از ژل الکتروفورز برای تفسیر نتایج PCR

نتایج یک واکنش PCR معمولا با استفاده از الکتروفورز ژل قابل مشاهده است. ژل الکتروفورز تکنیکی است که در آن قطعات DNA توسط جریان الکتریکی از طریق یک ماتریس ژل کشیده می‌شود و قطعات DNA را براساس اندازه جدا می‌کند. یک استاندارد به‌نام “ladder” نیز همراه نمونه‌ها معمولا گنجانده می‌شود تا اندازه قطعات در نمونه PCR تعیین شود. قطعات DNA با طول یکسان یک باند روی ژل تشکیل می‌دهند که اگر ژل با رنگ پیونددهنده DNA رنگ‌آمیزی شود، با چشم قابل مشاهده است. یک باند DNA حاوی کپی‌های بسیار زیادی از ناحیه DNA هدف است، نه فقط یک یا چند نسخه. از آن‌ جایی‌که DNA میکروسکوپی است، باید نسخه‌های زیادی از آن وجود داشته باشد تا بتوانیم آن را با چشم ببینیم.

آیا PCR روی RNA نیز کار می‌کند؟

RNA  یک مولکول تک ‌رشته‌ای مشابه DNA است. با یک مرحله اضافی، PCR  می‌تواند RNA را نیز تقویت کند. این روش RT-PCR نامیده می‌شود. “RT” مخفف ترانس کریپتاز معکوس است. این آنزیمی است که یک توالی RNA را می‌خواند و یک کپی DNA مکمل می‌سازد. RT-PCR  برای تشخیص عفونت با ویروس‌ها (مانند ویروس کرونا) که از RNA به‌عنوان ماده ژنتیکی خود استفاده می‌کنند، به کار گرفته می‌شود. همچنین می‌تواند RNA پیام‌رسان (mRNA) را تقویت کند. mRNA  مولکول واسطه‌ای است که سلول‌ها هنگام خواندن اطلاعات موجود در ژن‌های خود برای ساخت پروتئین می‌سازند. با نگاه کردن به mRNA یک سلول، می‌توان تشخیص داد که کدام یک از ژن‌های آن فعال یا روشن هستند.

جمع‌بندی

 PCR ناحیه خاصی از رشته DNA هدف را تقویت می‌­کند. اکثر روش­‌های PCR قطعات DNA با طول بین 1/0 تا 10 کیلو جفت باز (kbp)  را تکثیر می‌­کنند، اگرچه برخی از تکنیک­‌ها امکان تکثیر قطعات تا 40 کیلوبایت بر ثانیه را فراهم می­‌کنند. مقدار محصول تقویت‌‌شده توسط بسترهای موجود در واکنش تعیین می­‌شود که با پیشرفت واکنش محدود می­‌شود. این روش، ابزاری آسان و مقرون به ‌صرفه جهت تکثیر یک تکۀ خاص از DNA موردنظر است.

نویسنده: یاسمن اسمی

مترجم: مهرشید موسویون

منابع

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/
2. https://www.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/a/polymerase-chain-reaction-pcr
3. https://www.yourgenome.org/facts/what-is-pcr-polymerase-chain-reaction/
4. https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
5. https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-are-the-different-types-of-PCR
6. https://www.biocompare.com/PCR-Real-Time-PCR/PCR-Thermal-Cyclers-PCR-Thermocycler/
7. https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/mullis/lecture/
8. https://www.news-medical.net/life-sciences/History-of-Polymerase-Chain-Reaction-(PCR).aspx
9. https://www.yourgenome.org/facts/what-is-pcr-polymerase-chain-reaction/

تهیـه‌شـده در آکـــادمـی ژنـــتیـــک ایــران