ماکرومولکول طلایی به نام پروتئین (استخراج پروتئین)

تعریف مفهوم مهندسی ژنتیک

در فرآیند استخراج پروتئین، مهندسی ژنتیک مطرح می‌شود و لازمه‌ی دانستن استخراج پروتئین آشنا‌شدن با مفهوم مهندسی‌ژنتیک است. مهندسی‌‌ژنتیک، فرآیند اصلاح DNA یک موجود برای معرفی صفات جدید و مطلوب است.

سلول‌های یک انسان یا موجودات دیگر دارای بخش‌هایی به نام ژن هستند که واکنش‌های شیمیایی در سلول را کنترل می‌کنند که باعث رشد و عملکرد آن می‌شود و در نهایت رشد و عملکرد ارگانیسم را تعیین می‌کند. یک موجود زنده از هر یک از والدین برخی از ژن‌ها را به ارث می‌برد و بنابراین والدین ویژگی‌های خاصی را به فرزندان خود منتقل می‌کنند.

هدف مهندسی‌ژنتیک اصلاح ژن‌ها برای افزایش توانایی‌های ارگانیسم فراتر از حد‌طبیعی است. بسیاری از ارگانیسم‌ها، از باکتری‌ها گرفته تا گیاهان و حیوانات، برای مقاصد دانشگاهی، پزشکی، کشاورزی و صنعتی اصلاح ژنتیکی شده‌اند. مهندسی‌ژنتیک دارای مزایای مشخصی است اما با این حال نگرانی‌های اخلاقی در مورد اصلاح انسان‌ها و تامین مواد غذایی وجود دارد.

مهندسی‌ژنتیک، با استفاده از کد‌های ژنتیکی  امکان‌پذیر است زیرا کد‌ ژنتیکی روشی است که اطلاعات DNA  با آن رمزگذاری می‌شود. ساختار DNA در بین تمام اشکال حیات یکسان است. در نتیجه، کد‌ژنتیکی یک موجود زنده ممکن است به روش‌های مختلفی اصلاح شود. توالی نوکلئوتیدی ممکن است به صورت انتخابی با استفاده از تکنیک‌هایی مانند سیستم CRISPR/Cas9 ویرایش شود.

سیستم CRISPR/Cas9 که به عنوان قیچی‌مولکولی شناخته می‌شود، یک پاسخ ایمنی‌ذاتی و پروکاریوتی است که برای ویرایش اطلاعات‌ژنتیکی انتخاب شده‌است. همچنین ممکن‌است یک ژن از یک ارگانیسم حذف شود، یا برای ایجاد از طریق فرآیندی به نام هدف‌گیری ژن معرفی شود. دانشمندان همچنین می‌توانند ژنی را از یک موجود زنده به ژنوم موجود دیگر وارد کنند و در نتیجه یک ارگانیسم تراریخته ایجاد شود. به طور کلی DNA ترکیب‌شده از منابع مختلف، DNA نوترکیب نامیده می‌شود. ارگانیسمی که آن DNA را دریافت می‌کند یک ارگانیسم اصلاح‌شده ژنتیکی یا GMO در نظر گرفته می‌شود.

ماهیت پروتئین به عنوان یک ماکرومولکول طلایی

پروتئین‌ها، مولکول‌های بزرگ و پیچیده‌ای هستند که نقش‌های حیاتی زیادی در بدن دارند.  آنها بیشتر کار را در سلول‌ها انجام می‌دهند و برای ساختار، عملکرد و تنظیم بافت‌ها و اندام‌های بدن مورد نیاز هستند. پروتئین‌ها از صدها یا هزاران واحد کوچک‌تر به نام اسیدهای‌آمینه تشکیل شده‌اند که در زنجیره‌های طولانی به یکدیگر متصل هستند.

20 نوع مختلف اسید‌آمینه وجود دارد که می توان آن‌ها را برای ساخت پروتئین ترکیب کرد.  توالی اسیدهای آمینه ساختار سه بعدی منحصر به فرد هر پروتئین و عملکرد خاص آن را تعیین می‌کند.  اسیدهای‌آمینه با ترکیبی از سه بلوک ساختمانی DNA (نوکلئوتیدها) کدگذاری می‌شوند که توسط توالی ژن‌ها تعیین می‌شوند.

اشکال مختلف پروتئین‌ها در بدن

پروتئین‌ها را می‌توان با توجه به طیف وسیعی از عملکردهای آنها در بدن توصیف کرد که به‌ترتیب  عبارت‌اند از: آنتی‌بادی، آنزیم،  پیام‌رسان، جز ساختاری، حمل و نقل / ذخیره سازی.

ژن‌ها چگونه تولید پروتئین‌ها را هدایت می‌کنند؟

بیشتر ژن‌ها حاوی اطلاعات مورد نیاز برای ساخت مولکول‌های عملکردی به نام پروتئین هستند. (چند ژن مولکول‌های تنظیم‌کننده‌ای تولید می‌کنند که به سلول کمک می‌کند تا پروتئین‌ها را جمع‌آوری کند.) سفر از ژن به پروتئین پیچیده است و در هر سلول به شدت کنترل می‌شود. این شامل دو مرحله اصلی است: رونویسی و ترجمه.

رونویسی و ترجمه با‌هم به‌عنوان بیان‌ژن شناخته می‌شوند. در طی فرآیند رونویسی، اطلاعات ذخیره شده در DNA یک ژن به مولکولی مشابه به نام RNA (ریبونوکلئیک اسید) در هسته سلول منتقل می‌شود. RNA و DNA هر دو از زنجیره‌ای از بلوک‌های ساختمانی به نام نوکلئوتید ساخته‌شده‌اند، اما خواص شیمیایی کمی متفاوت دارند.

 نوع RNAی که حاوی اطلاعات ساخت پروتئین است RNA پیام‌رسان (mRNA) نامیده می‌شود زیرا اطلاعات یا پیام را از DNA از هسته به‌داخل سیتوپلاسم می‌برد. ترجمه، مرحله دوم در رسیدن از یک ژن به پروتئین، در سیتوپلاسم انجام می‌شود. mRNA با یک مجموعه تخصصی به نام ریبوزوم که توالی نوکلئوتیدهای mRNA را خواند می‌کند، برهم‌کنش می‌کند. هر توالی از سه نوکلئوتید که کدون نامیده می‌شود، معمولاً یک اسید آمینه خاص را کد می‌کند. (اسیدهای آمینه بلوک های سازنده پروتئین ها هستند.)

نوعی از RNA به نام RNA‌انتقالی (tRNA) پروتئین را در یک زمان یک اسید آمینه جمع می‌کند.  مونتاژ پروتئین تا زمانی ادامه می‌یابد که ریبوزوم با کدون توقف (توالی از سه نوکلئوتید که برای یک اسید آمینه کد نمی‌کند) مواجه‌شود. جریان اطلاعات از DNA به RNA به پروتئین‌ها یکی از اصول‌اساسی زیست‌شناسی‌مولکولی است. آنقدر مهم است که گاهی به آن «Central dogma » می‌گویند.

مروری بر ساختار پروتئین

بلوک‌های سازنده پروتئین‌ها آمینواسیدها هستند که مولکول‌های آلی کوچکی هستند که از یک اتم کربن آلفا (مرکزی) متصل به یک گروه آمینه، یک گروه کربوکسیل، یک اتم هیدروژن و یک جزمتغیر به نام زنجیره‌جانبی یا R تشکیل شده‌اند. در یک پروتئین، چندین اسید‌آمینه با پیوندهای پپتیدی به یکدیگر متصل می‌شوند و در نتیجه یک زنجیره طولانی تشکیل می‌دهند.

پیوندهای پپتیدی توسط یک واکنش بیوشیمیایی ایجاد می‌شود که یک مولکول آب را در حین پیوستن به گروه.آمینه یک اسید‌آمینه به گروه کربوکسیل یک اسید‌آمینه مجاور استخراج می‌کند. توالی خطی اسیدهای‌آمینه در یک پروتئین ساختار اولیه پروتئین در‌نظر گرفته می‌شود.

پروتئین‌ها از مجموعه‌ای متشکل از بیست اسید‌آمینه ساخته می‌شوند که هر کدام یک زنجیره‌جانبی منحصربه‌فرد دارند. زنجیره‌های‌جانبی اسیدهای‌آمینه دارای ترکیب شیمیایی متفاوتی هستند. بزرگترین گروه اسیدهای‌آمینه دارای زنجیره‌های جانبی غیرقطبی هستند. چندین آمینو‌اسید دیگر دارای زنجیره‌های جانبی با بارهای مثبت یا منفی هستند، درحالی‌که برخی دیگر دارای زنجیره‌های جانبی قطبی اما بدون بار هستند. 

شیمی زنجیره‌های جانبی اسید‌آمینه برای ساختار پروتئین بسیار مهم است زیرا این زنجیره‌های جانبی می‌توانند با‌یکدیگر پیوند برقرار کنند تا طول پروتئین را در شکل یا ترکیب خاصی نگه دارند. زنجیره‌های جانبی اسید‌آمینه باردار می‌توانند پیوندهای یونی تشکیل‌دهند و اسیدهای‌آمینه قطبی قادر به تشکیل پیوندهای هیدروژنی هستند. زنجیره‌های جانبی آبگریز از طریق برهمکنش‌های ضعیف واندروالسی با یکدیگر تعامل دارند. اکثریت قریب به اتفاق پیوندهای تشکیل شده توسط این زنجیره‌های جانبی غیرکووالانسی هستند.

در واقع، سیستئین‌ها تنها اسیدهای‌آمینه‌ای هستند که قادر‌به تشکیل پیوندهای کووالانسی هستند که با زنجیره‌های‌جانبی‌ خاص خود انجام می‌دهند. به دلیل فعل و انفعالات زنجیره‌جانبی، توالی و محل اسیدهای‌آمینه در یک پروتئین خاص، جایی که خمیدگی‌ها و چین‌ها در آن پروتئین رخ می‌دهد، هدایت می‌کند.

مقدمه‌ای بر روش‌های استخراج پروتئین در مهندسی‌ژنتیک

پروتئین یک ماکرومولکول است که از زنجیره‌ای از باقی‌مانده اسیدهای آمینه تشکیل شده‌است که عملکردهای حیاتی را در بدن کامل می‌کند. پروتئین‌ها از تکثیر DNA گرفته تا کاتالیزور واکنش‌های شیمیایی گرفته تا پشتیبانی‌ساختاری، وظایف بی‌نهایتی را در بدن انجام می‌دهند که برای بقای ارگانیسم ضروری است. 

پروتئین‌ها اغلب بر اساس ساختارشان طبقه‌بندی می‌شوند که تعداد زنجیره‌های اسید آمینه شکل و الگوی فیزیکی آن را در نظر می‌گیرد. هر‌جنبه‌ای از بدن از سلول‌های منفرد، ساخت تا بافت‌ها و کل اندام‌ها به تعادل دقیق پروتئین‌ها برای عملکرد بهینه نیاز دارد. در نتیجه، مطالعه پروتئین‌ها در بحث استخراج پروتئین در مهندسی‌ژنتیک مهم است.

پروتکل استخراج پروتئین

 عامل مهمی که باید هنگام انتخاب پروتکل استخراج پروتئین در مهندسی‌ژنتیک در نظر بگیرید منبع پروتئین و مکان آن در سلول است. پروتئین‌ها را می‌توان از بافت‌ها یا سلول‌ها استخراج کرد. استخراج پروتئین از بافت به مراحل بیشتری نیاز دارد زیرا لایه‌های بیشتری وجود دارد و ناهمگنی شیمیایی و ساختاری در سراسر نمونه وجود دارد. برای کشت سلولی، نیازی نیست نمونه خود را به صورت مکانیکی همگن کنید، اما بقیه مراحل به طور کلی یکسان است.

مراحل کلی استخراج پروتئین

استخراج پروتئین در مهندسی‌ژنتیک شامل مراحل زیر است:

1. سلول‌ها باید از طریق فراصوت لیز  یا بافت  به‌صورت مکانیکی همگن شوند  تا پروتئین‌ها آزاد گردند.
2. فیلتراسیون نمونه برای حذف بقایای بزرگتر بایستی پس از مرحله‌ی اول صورت گیرد.
3. سپس نمونه را سانتریفیوژ کنید تا بقایای سلولی حذف شود و مایع رویی یا سوپرناتانت را جمع‌آوری کنید. این مرحله برای استخراج پروتئین‌های سیتوپلاسمی مفید است. نوع مناسب سانتریفیوژ را برای هدف خود انتخاب کنید: معمولاً از گرادیان چگالی و سانتریفیوژ دیفرانسیل استفاده می‌شود.
4. نمونه را مجددا در یک بافر مناسب معلق کنید، که تحت تأثیر نوع پروتئینی است که می‌خواهید استخراج کنید.  برای مثال می‌توان از بافرهای شیمیایی حاوی مواد‌شوینده برای استخراج پروتئین‌های غشایی استفاده‌کرد.
5. جداسازی بیومغناطیسی یک مرحله اضافی اختیاری برای غنی‌سازی پروتئین هدف در محلول است.  پروتئین‌ها توسط ذرات مغناطیسی به پروتئین‌های گیرنده متصل می‌شوند. ذراتی که به پروتئین هدف متصل شده، توسط قفسه جداسازی مغناطیسی حفظ می‌شوند در حالی که بافر حذف می‌شود.

کیت‌های مورد استفاده در خالص سازی پروتئین در مهندسی‌ژنتیک

این کیت با بالاترین استاندارد مواد شیمیایی خالص تهیه شده است. کیت BioChain حاوی معرف های کافی برای بازیابی پروتئین ها از حداکثر 5 گرم بافت یا 125 میلیون سلول است. این کیت با بهره‌وری بالا مورد استفاده در روش‌های SDS-PAGE و ایمونوبلات بر روی انواع مختلف پروتئین‌های نشانگر موجود در انسان آزمایش می‌شود. این کیت چهار نوع پروتئین را استخراج می کند:

1. سیتوپلاسمی: این پروتئین‌ها در سیتوزول سیتوپلاسم سلولی وجود دارند. این ناحیه مایع مسئول فرایندهایی مانند: گلیکولیز یا تقسیم سلولی است.
2. هسته‌ای: پروتئین‌های موجود در داخل هسته سلول، از جمله آنهایی که کروموزوم ها را تشکیل می دهند، اشاره دارد.
3. غشا: این پروتئین‌ها لایه‌های بیرونی سلول‌ها و بافت‌ها را تشکیل می‎‌دهند. عملکرد آنها شامل حمل و نقل/ ارتباط بین محیط داخلی و خارجی سلول و اتصال به دولایه لیپیدی پروتئین‌های دیگر است.
4. اسکلت سلولی: پروتئین‌های این بخش از ساختار یک سلول مانند پشتیبانی، انتقال و تقسیم تشکیل شده‌است.

سخن پایانی

به واسطه‌ی پیشرفت علم تاثیرگذار ژنتیک، متد‌ها و روش‌های مختلفی برای استخراج و ارتباط با اجزای مولکولی و درون سلولی به وجود آمده‌است. در کنار تمام مزایایی که پیشرفت در هر زمینه‌ای وجود دارد یک سری معایب هم وجود دارد.

مهندسی ژنتیک، صلاحی جهانی‌است که امروزه استفاده از آن در راه درست و رعایت ملاحظات اخلاقی  دغدغه‌ی تمامی فعالان این حوزه ‌است.

#آکادمی_ژنتیک

نویسنده: هما پورافشار

منابع

biochain ncbi sepmag