اسپور باکتری ها

مقدمه

برخی از باکتری­‌ها قادر به ایجاد اسپور هستند، اسپور یا آندواسپور مرحله استراحت مقاومت در باکتری­‌ها است. اسپورها می توانند در شرایط نامساعد که باکتری­ ها قادر به تحمل آن نیستند،مانند: حرارت، سرما، خشکی، مواد­شیمیایی، تشعشعات و … زنده بمانند. هر باکتری فقط یک اسپور می­‌سازد و از هر اسپور یک باکتری بوجود می­‌آید.اسپور ممکن است کروی یا بیضی باشد اندازه آن بین ۴ تا ۲ میکرون است.

در برخی از موارد قطر اسپور از قطر باکتری بزرگ­تر است و باعث ایجاد برجستگی در شکل باکتری می‌­شود،گاهی نیز اسپور هم­ اندازه یا کوچک­تر از باکتری است.اسپور را به علت شفافیت و شکست زیاد نور می ­توان با میکروسکوپ فاز کنتراست مشاهده نمود. اگر باکتری‌­ها را به روش گرم رنگ­ آمیزی کنید اسپور را به ­صورت منطقه­ ای شفاف مشاهده می­‌کنید.

اسپور چیست؟

اسپور باکتری ،ساختاری کروی یا بیضی شکل می‌باشد که دارای چندین لایه‌ی پروتئینی است و در شرایط نامساعد محیطی مثل دماهای بالا، تشعشعات، خشکسالی و عوامل شیمیایی بسیار مقاوم است‌.اسپورهای باکتریایی، خفته‌ترین شکل باکتری‌ها هستند؛ زیرا حداقل متابولیسم، تنفس و همچنین کاهش تولید آنزیم را نشان می‌دهند.

از جمله باکتری ­هایی که دارای آندواسپور هستند:

می­توان جنس ­های کلستریدوم و باسیلوس، اسپوروسارسینا، اسپورولاکتوباسیلوس، دسولفوتوماکولوم، کوکسیلا بورتنی (ریکتزیای عامل تب کیو) را نام برد. اسپور یا آندوسپور در واقع مرحله استراحت و شکل مقاوم باکتری می‌­باشد. همه باکتری ­ها قادر به تولید اسپور نیستند. باسیلوس­ ها و کلستریدیوم­ ها دو جنس مهم باکتریایی تولید کننده اسپور می­‌باشند. سایر گونه­ های اسپورزا مثل اسپوروسارسینا و کوکسیلابورنتی هستند.

در فرآیند اسپورولاسیون، هر باکتری فقط یک اسپور می­سازد و از هر اسپور تنها یک باکتری بوجود می ­آید، بنابراین تولید اسپور در باکتری­ها به­ عنوان یک فرآیند تکثیری به شمار نمی‌­رود. در هر باکتری اسپوردار؛ شکل، اندازه و محل استقرار اسپور ویژگی ثابتی می­باشد و این خصوصیات می­تواند به­ عنوان کلید تشخیصی در شناسایی باکتری ­های اسپور زا و در آزمایشگاه بالینی مورد استفاده قرار گیرند.

ساختار اسپور باکتری به چه صورت است؟

به طور کلی موقعیت قرار گرفتن اسپور در سلول مادر به سه حالت؛ مرکزی(Central)، انتهایی(Terminal) و نزدیک انتهایی(Subterminal) می­‌باشد و شکل اسپور هم به صورت کروی (Spherical) و بیضی(Oval) مشاهده می­‌شود. اندازه اسپور کلستریدیوم ها بزرگتر از سلول والد بوده و موجب تورم و تغییر شکل سلول مادر می­شود ولی اندازه اسپور در جنس باسیلوس­ ها کوچکتر از سلول والد می­باشد.

ساختار اسپور باکتریایی چگونه است؟

• Core:

پروتوپلاست اسپور است که حاوی یک هسته کامل ( کروموزوم) و تمام اجزاء سیستم تولید پروتئین و یک سیستم تولید انرژی از طریق گلیکولیز می­باشد. انرژی مورد نیاز اسپور بیشتر بصورت ۳-فسفوگلیسرات ذخیره می­‌شود.

• Inner membrane:

داخلی­ ترین لایه اطراف اسپور را تشکیل می­دهد.

• Germ cell wall:

دیواره اسپور، غشاء داخلی اسپور را احاطه می­کند.این دیواره از پپتیدوگلیکان معمولی تشکیل شده و دیواره سلولی باکتری فعال و زایای بعدی را تشکیل می­دهد.

• Cortex:

کورتکس ضخیم ­ترین لایه پوشش اسپور است.این لایه از نوعی پپتیدوگلیکان غیر معمول ساخته شده است که تعداد پل های عرضی آن از پپتیدوگلیکان دیواره سلولی بسیار کمتر است.این لایه به شدت نسبت به لیزوزیم حساس بوده و اتولیز آن در زایا شدن نقش دارد.

• Outer membrane:

این لایه از یک پروتئین شبه کراتینی با پیوندهای دی­ سولفیدی زیاد ساخته شده است. مقاومت نسبی اسپور در برابر عوامل شیمیایی مربوط به نفوذ ناپذیری این لایه می­باشد.

• Exosporium:

اگزواسپور خارجی­ ترین لایه بوده و از جنس لیپوپروتئین است.

مقاومت اسپور باکتری

همانطورکه اشاره شد، اندوسپور در مقابل شرایط نامساعد از جمله؛ حرارت، سرما، خشکی، مواد شیمیایی، تشعشعات و غیره، مقاوم است.اسپور قادر است حرارت ۱۰۰ درجه سانتی­گراد را چندین ساعت تحمل کند، بنابراین برای از بین بردن اسپور حرارت مرطوب ۱۲۰ درجه سانتی­گراد به مدت ۱۵ تا ۲۰ دقیقه اعمال می­ شود.

برخی منابع مقاومت اسپور را به دو عامل نسبت می­دهند:

1. وضعیت دهیدراته بودن اسپور
2. وجود مقادیر زیاد کلسیم دی پیکولینات

ولی به طور عمده علت مقاوم بودن اسپور را به ضخامت جداره، نفوذ ناپذیری، کم بودن فعالیت متابولیکی و کم بودن آب آن نسبت می‌­دهند.

رنگ آمیزی آندوسپور

آندوسپور به دلیل نفوذ ناپذیر بودن به آسانی رنگ نمی­ گیرد و در صورت رنگ پذیری به آسانی رنگ خود را از دست نمی دهد.این خاصیت اساس و پایه رنگ­ آمیزی اسپور را تشکیل می­دهد.اسپور به وسیله رنگ مالاشیت گرین و با کمک حرارت رنگ ­آمیزی می­ شود، سپس سافرانین به عنوان رنگ مکمل در این تکنیک مورد استفاده قرار می‌­گیرد.در این روش باکتری ها قرمز رنگ و آندوسپورها به رنگ سبز در داخل پیکر باکتری والد مشاهده می­شوند. اگر باکتری اسپور دار به روش گرم رنگ­ آمیزی شوند و اسپورها به صورت مناطق شفافی قابل مشاهده خواهند بود.همچنین اندوسپور را می­ توان به علت شفافیت با میکروسکوپ فاز کنتراست مشاهده کرد.

روش های رنگ­ آمیزی اسپور باکتری شامل:

1. روش شافر- فولتون (schaeffer-fulton)
2. روش دورنر (Dorner method)
3. روش مولر

آزمایش روش شافر- فولتون (schaeffer-fulton)

طرز تهیه رنگ ­ها و محلول­ ها:

• مالاشیت گرین (محلول5/0%)

۵ گرم مالاشیت گرین را در ۱۰۰سی سی آب مقطر حل کنید.

• سافرانین ( محلول 5/0%)

۰.۵ گرم سافرانین را در ۱۰۰سی سی آب مقطر حل کنید.

روش آزمایش:

• از باسیلوس سوبتیلیس گسترش تهیه نمایید و پس از خشک شدن با حرارت ثابت کنید.
• گسترش را با سبز مالاشیت پوشانده و به مدت ۵ دقیقه روی حرارت حمام آب جوش قرار دهید.
• مراقب باشید تا رنگ نجوشد و خشک نشود. برای جلوگیری از خشک شدن می­ توانید دوباره مقداری از سبز مالاشیت را روی لام اضافه نمایید.
• رنگ را از روی لام خالی نمایید و با آب آن را بشویید.
• با سافرانین به مدت یک دقیقه گسترش را بپوشانید.
• رنگ را خالی نموده و با آب لام را بشویید.
• با کاغذ خشک کن لام را خشک نمایید و با روغن ایمرسیون و عدسی ۱۰۰ میکروسکوپ مشاهده کنید
• در این روش رنگ­ آمیزی، اسپورها به رنگ سبز و باکتری­ها به رنگ قرمز مشاهده می ­شوند.

روش آزمایش به روش دورنر(Dorner Method)

• پنج قطره آب مقطر سترون را درون لوله آزمایش بریزید و باکمک فیلدوپلاتین کلنی باسیلوس سوبتیلیس را به درون لوله انتقال داده و سوسپانسیون غلظی از آن تهیه نمایید.
• پنج قطره از کربول فوشین را به سوسپانسیون داخل لوله اضافه نمایید.
• لوله آزمایش را به مدت ۱۰ دقیقه درون آب جوش قرار دهید.
• قطره کوچکی از محلول ۱۰% نیگروزین را روی لام قرار داده و چند لوپ از سوسپانسیون فوق را در آن حل نمایید.
• با استفاده از انتهای یک لام، قطره مذکور را روی لام پخش کنید.
• صبر کنید تا گسترش به دست آمده در حرارت آزمایشگاه خشک شود.
• آب مقطر ۱۰۰ ميلي ليترمیکروسکوپ با عدسی ۱۰۰ مشاهده نموده

طرز تهیه رنگ كربول فوشين مورد استفاده در این روش:

• فوشين قليائي ۴ گرم
• الكل اتانول ۲۰ ميلي لیتر
• فنل ۸ ميلي گرم
• آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

آب مقطر را به آرامی با فنل مخلوط نموده و سپس محلول رنگ فوشین در الکل را به آن اضافه کنید.حجم نهایی را به خوبی مخلوط نموده و برای یک شب در حرارت ۳۷ درجه سانتیگراد باقی بگذارید.سپس با استفاده از کاغذ صافی آن را صاف کنید.در این روش زمینه لام سیاه رنگ، اسپور قرمز رنگ و باکتری بی رنگ است.

رنگ­ آميزي اسپور باکتری به روش مولر

• گسترش را با حرارت ثابت كنيد.
• فوشين فنيكه غليظ را روي لام بريزيد و به ملايمت حرارت دهيد تا به مدت ۱۰ دقيقه بخار متصاعد شود ولي رنگ روي لام نجوشد و خشك نشود (توصيه مي­شود براي حرارت دادن لام را بر روي پايه فلزي قرار دهيد)
• لام را با آب بشوئيد.
• بوسيله الكل مطلق عمل رنگ­بري را انجام دهيد تا گسترش به رنگ گلي كم رنگ درآيد.
• لام را با آب بشوئيد.
• متيلين بلو را روي گسترش ريخته و ۳ دقيقه صبر كنيد.
• لام را با آب بشوئيد.

پس از خشك كردن لام با استفاده از روغن سدر و عدسي ۱۰۰ آنرا زير ميكروسكوپ مطالعه كنيد.

اسپورها به رنگ قرمز و باکتری­ها به رنگ آبي ديده مي­شوند.

نتیجه گیری

برای تشخیص اسپور­ باکتری ها در زیر میکروسکوپ با توجه به روشی که برای رنگ­ آمیزی انتخاب کرده ­ایم طبق مطالب زیر اسپور­ها را تشخیص می­دهیم.در روش رنگ ­آمیزی شافر-فولتون، اسپورها به رنگ سبز و باکتری­ ها به رنگ قرمز مشاهده می­ شوند.در روش دورنر زمینه لام سیاه رنگ، اسپور قرمز رنگ و باکتری بی­رنگ است در روش مولر اسپورها به رنگ قرمز و باکتری­ ها به رنگ آبي ديده مي­‌شوند.

تهیه کننده: فاطمه گودرزی

منابع:

1. https://darwino.ir/coloring_instructions_for_spores/
2. http://rotbeyek.com/%D8%B1%D9%88%D8%B4-%D8%B1%D9%86%DA%AF-%D8%A2%D9%85%DB%8C%D8%B2%DB%8C-%D8%A7%D8%B3%D9%BE%D9%88%D8%B1-%D8%A8%D8%A7%DA%A9%D8%AA%D8%B1%DB%8C-%D9%87%D8%A7-spore-staining

همچنین مطالعه کنید: سلول‌های نوروگلیا