نمایش فاژی پادتن‌ها برای کاربردهای تشخیصی

انواع سلول‌های نوروگلیا و ویژگی‌هایشان

مؤلف : سعید زارع

سعید زارع،دانشگاه پیام نور،واحد شیراز،مرکز،گروه ریاضیات و کاربردها،شیراز،ایران

ایمیل: saeedzare887@gmail.com

چکیده

با تحولات عمده در بیولوژی مولکولی، فناوری‌های نمایش متعددی برای تولید پادتن نوترکیب، بطور موفقیت آمیزی معرفی شده‌اند. این موفقیت‌ها، اساسا مرهون ذات مقاوم ذرات فاژی و سازگاری با اصلاحات است. تولید اتصال دهنده‌های تک خواصی، ابزاری حیاتی برای تشخیص با هزینه پایین‌تر و کارایی بالاتر را فراهم می‌کند. انعطاف‌پذیری در اصلاح پادتن‌های نوترکیب منجر به کاربرد پذیری زیادی در پلتفورم‌های مختلف شده است. در این مقاله، مروری بر فناوری نمایش فاژی، کاربرد و اصلاحات پادتن‌های نوترکیب برای تشخیص، ارائه شده است.

کلمات کلیدی: نمایش فاژی، پادتن‌ها، تشخیص، ScFv

1- مقدمه

فناوری هیبریدوما، سنگ بنای اصلی برای تولید پادتن تک خواصی است. تولید پادتن تک تیره با استفاده از فناوری هیبریدوما شامل ترکیب یک سلول میلونای فنا ناپذیر با یک سلول تولید کننده پادتن است. با این حال، استفاده از فناوری هیبریدوما برای تولید پادتن‌های تک تیره، با موانعی روبرو است (جدول (1)). ظهور فناوری DNA نوترکیب منجر به تکامل روش‌های تولید پادتن گردیده است. تولید پادتن نوترکیب، با معرفی روش‌های نمایش آزمایشگاهی تحقق یافته است.

روش‌های نمایش آزمایشگاهی نظیر نمایش فاژی، بعنوان یک راه حل جایگزین مهم برای تولید پادتن‌های تک تیره‌ی انسانی نوترکیب، معرفی شده‌اند. این یک فرآیند آزمایشگاهی است که مستقل از مقرارت سیستم ایمنی می‌باشد. در رایج‌ترین روش نمایش فاژی، از باکتریوفاژ رشته‌ای M13 استفاده می‌شود. توانایی یک باکتریوفاژ در ارائه هدف نوترکیب بر روی سطحش، توسط گئورگ اسمیت با کار بر روی پپتیدها، مشخص گردید. در بررسی او، ژن‌ها، پپتیدهای مخلوط با پروتئین غشایی PIII را رمز کردند. پس از موفقیت در بسته بندی ذرات فاژ حاوی توالی ژن پپتید، پپتید بعنوان یک پپتید مخلوط با پروتئین غشایی PIII  بیان خواهد شد. منحصرا، هر ذره فاژی، یک پپتید واحد بر اساس ژن‌های کد شده در سیستم را ارائه خواهد کرد و این اطلاعات براحتی با اتصال فیزیکی بین فنوتیپ و ژنوتیپ، استخراج می‌شوند. ارائه پادتن در سطح فاژ، در روش مشابه با مخلوط ژن پادتن با ژن PIII از رشته فاژی به منظور ارائه فتوتیپیِ پروتئین پادتن بعنوان ترکیبی با پروتئین غشایی III، انجام می‌گیرد.

پادتن‌های سنتی، بطور گرافیکی به‌صورت ساختار Y شکل (شکل (1)) با دو انتهای یکسان، نشان داده می‌شوند. در هر انتها، یک زنجیره سنگین توسط پیوندهای دی‌سولفید دورن زنجیری به یک زنجیره سبک متصل است تا قطعه اتصالی آنتی‌ژن (Fab)[1] را تولید نماید. در ساختار Fab، بسته‌های اتصالیِ پادتن از حوزه‌های سبک و سنگین متغیر ساخته شده‌اند. معرفی پادتن‌های نوترکیب توسط نمایش فاژی، تجمعی از قالب‌های پادتن جدید را نیز معرفی کرد. قالب‌های جدیدتر نظیر پادتن‌های انسانی، پادتن‌های شتر، پادتن‌های کوسه‌، قطعه تک زنجیره‌ای متغیر [2](scFv)، scFv های پشت سر هم، دیابادی، تترابادی، مینی‌بادی و قطعه آنتی‌ژن تک زنجیری، معرفی شده‌اند. معرفی قالب‌های جدیدتر به پژوهشگران این اجازه را می‌دهد که بر محدودیت‌های تحمیل شده توسط ماشین فولدینگ اشرشیا کلی (E. Coli) غلبه کنند. این دلیل آن است که چرا قطعات کوچکتر نظیر پادتن‌های حوزه‌ای، scFv و Fab برای نمایش فاژی استفاده شده‌اند.

غیر از نمایش فاژی، شماری از فناوری‌های جدید نمایش نیز معرفی شده‌اند تا چالش تولید پادتن را بر طرف کنند. فناوری‌های نمایش نظیر نمایش مخمری، ریبوزومی، پلاسمید مبتنی بر پورومایسین، باکتریایی، باکولوویروس و CIS، بطور موفقیت آمیزی برای تولید پادتن‌های نوترکیب استفاده شده‌اند.

جدول 1- مقایسه تولید پادتن تک تیره با استفاده از فناوری هیبریدومای مرسوم و فناوری نمایش فاژی

سه روش نمایش اصلی که معمولا برای تولید پادتن استفاده می‌شوند، نمایش فاژی، مخمری و ریبوزومی هستند. اصل اساسی تمام این فناوری‌های نمایش، باقی نگه داشتن اتصال فیزیکی بین ژنوتیپ و فنوتیپی که ضروری است، می‌باشد.

در نمایش ریبوزومی، پادتن در آزمایشگاه با استفاده از سیستم‌های بیان سلولی آزاد پروکاریوتی یا یوکاریوتی رونویسی و ترجمه می‌شوند. یک سیستم نمایش ریبوزومی، به محیطی نیاز دارد که در آن غلظت یون منیزیم بالا، دما پایین و طراحی پلاسمید بدون توقف کدون برای عملکرد بهینه است. این ترکیب به ریبوزوم اجازه می‌دهد که در انتهای mRNA آرام گیرد در حالی‌که پادتن فرآوری شده خودش را برای انتخاب در خارج از تونل ریبوزوم قرار می‌دهد. مزیت اصلی نمایش ریبوزومی، تقویت و جفت شدن ژنوتیپ- فنوتیپ در محیط آزمایشگاهی است که اجازه دستکاری آسان‌تر در کتابخانه‌های بزرگتر را بر خلاف نمایش فاژی می‌دهد. کتابخانه‌های بزرگ‌تر می‌توانند بسرعت در نمایش ریبوزومی تولید شوند چراکه انتقال شمار زیادی از پلاسمیدها در یک میزبان، لازم نیست. این سیستم، اجازه‌ی کپی‌برداری آسان از فرآیند الکترون خواهی را با جهش‌های مجاز می‌دهد تا در هر دور انتخابی ارائه شود، چرا یک مرحله واکنش زنجیره‌ی پلیمراز (PCR)[1] بجای تقویت در موجود زنده مورد نیاز است. اگرچه، نمایش ریبوزومی می‌تواند اشکالات تولید کتابخانه مرتبط با روش‌های نمایش آزمایشگاهی را رفع کند، اما دارای برخی اشکالات نیز هست. برخی مشکلات مرتبط با نمایش ریبوزمی ناشی از دستکاری بسیار دقیقی‌ست که بعنوان mRNA در پیچه‌های ریبوزومی که به‌آسانی توسط RNAse قابل تجزیه‌اند، لازم است. پایان زودهنگام ترجمه پروتئین بعنوان یک نتیجه محتمل ناشی از جلوگیری از پیشروی در انتهای mRNA، مانع دیگر در این روش است. در نمایش ریبوزومی، تجزیه پلی‌پپتید سنتز شده در پیچه ریبوزومی، نرخ موفقیت آزمایشگاهی را بخاطر از دست رفتن اتصال ژنوتیپ و فنوتیپ، کاهش می‌دهد. این عوامل، نمایش ریبوزمی را برای آزمایش‌کننده با چالش روبرو می‌کند.

فناوری نمایش مخمری، قالب‌های پادتن را بر روی Saccharomyces cerevisiae با ارائه پادتن بعنوان پروتئین ترکیبی با پیچه‌ی گیرنده آگلوتینین (Aga1 و Aga2)، ارائه می‌دهد. پروتئین Aga2p بعنوان واسط تعامل سلول به سلول در حین جفت شدن سلول مخمر عمل می‌کند. ارائه پروتئین‌های پادتن بعنوان ترکیبات Aga2p، اجازه ارائه مناسب پادتن‌های دور از سطح سلول را می‌دهد و تعامل با دیگر مولکول‌های دیواره سلول مخمر را کاهش می‌هد. مزیت اصلی این پلتفورم در بیان یوکاریوتی و مکانیزم پردازش بالا، تضمین پایداری و الکترون خواهی و توانایی اصلاح فاصله مخمری است. اصلاح فاصله S. cerevisiae، یک فرآیند نوترکیبی دورنی است که اجازه قرار دادن ژن‌ها در پلاسمیدها را در موقعیت‌های دقیق بدون نیاز به آنزیم‌های محدود کننده، می‌دهد. این کار، اجازه تولید آسان کتابخانه و غنی‌سازی الکترون خواهی نواحی CDR را می‌دهد. مزیت بزرگ، مرتب سازی سلول فعال شده توسط فلورسنت (FACS)[2] برای پنینگ (جفت سازی) نمایش مخمر است تا بیان پادتن یا کارایی اتصال پادتن- آنتی‌ژن را با آنتی‌ژن‌های برچسب گذاری شده توسط فلورسنت، نظارت کند. خلل اصلی این فناوری، ابعاد کوچکتر کتابخانه‌های پادتن استفاده شده بخاطر محدودیت بازده تبدیل مخمر است. مشکل دیگر، همانطور که با انتخاب پادتن‌های پروتئین کالمودولین پستاندار (CaM) گزارش شده است، از دست رفتن عملکرد پروتئین پس از بیان در شکل قابل حل است. از دست رفتن توانایی اتصال، با مشارکت Aga2 در ترکیب با مولکول پادتن، توجیه شده است. بنابراین، وقتی پادتن در شکل قابل حل بدون Aga2 بیان می‌شود، پادتن نمی‌تواند به آنتی‌ژن با عملکرد مشابه متصل شود.

در مقایسه با روش‌های نمایش آزمایشگاهی، روش هیبریدوما مرسوم معایبی دارد که آن را برای تولید پادتن، غیر جذاب می‌کند. زمان موردنیاز برای تولید پادتن‌های نوترکیب با استفاده از روش‌های نمایش، تقریبا کوتاه‌تر از روش هیبریدوما مرسوم که می‌تواند تا ماه‌ها طول بکشد، است. انتخاب روش‌های نمایش بعنوان روش جایگزین، با توانایی کنترل دقیق و شرایط انتخاب دستکاری برای ویژگی‌های خاص پادتن‌ها، افزایش یافته است. انعطاف پذیری روش‌های نمایش به غلبه بر مشکل تولید پادتن‌های مخالف با خود کمک می‌کند. این کار بخاطر فرآیند تولید کتابخانه، ممکن است اجازه ترکیب زنجیره‌های سبک و سنگین را که معمولا بطور ذاتی برای ارائه وجود ندارند را بدهد. ویژگی جالب دیگر پادتن‌های نوترکیب، ایجاد انتخاب پذیری در حین فرآیند کلون کردن است. الکترون خواهی پادتن‌های انتخابی با روش‌های آزمایشگاهی، ممکن است پادتن‌های در محدوده‌ی پیکومولار تا فمتومولار تولید ‌کند. درجه آزادی‌ای که برای پژوهشگران توسط فناوری نمایش فاژی پادتن ارائه می‌شود، منجر به ایجاد محبوبیت برای کاربردهای تشخیص می‌شود. با وجود معرفی پلتفورم‌های فناورانه‌ی مختلف، نمایش فاژ برای تولید پادتن نوترکیب بخاطر پایداری، مقاومت روش و انعطاف پذیری،‌ هنوز بعنوان انتخاب ارجحی باقی مانده است تا شرایط مطلوب کاربر را برقرار سازد.

– نمایش فاژی کتابخانه‌های پادتن

موفقیت هر آزمایش نمایش فاژ در حصول پادتن‌های با کیفیت خوب، بشدت وابسته به مجموعه پادتن‌های ارائه شده است. مجموعه یا کتابخانه‌ی پادتن‌ها، مجموعه‌ای از ژن‌های متغیر پادتن است که بعنوان ترکیبی با

پروتئین غشا فاژی با ابعاد کتابخانه در محدوده  تا  بسته به نوع کتابخانه تولید شده، هستند. کتابخانه‌های پادتن، با حصول ژن‌های رمز کننده پادتن‌ها از سلول‌های B با تقویت PCR توسط مجموعه‌ای از محرک‌های خاص ، ساخته شده‌اند تا میزان قابل توجهی از DNA را برای کلون کردن، حاصل کنند. تنوع این ژن‌ها از طبیعت فرآیندهای موجود زنده نظیر نوترکیبی V(D)J مشتق می‌شود. منبع ژن‌های پادتن، می‌تواند برپایه منشاء توالی‌های پادتن موجود بصورت طبیعی یا مصنوعی، دسته بندی شود. کتابخانه‌های با منبع طبیعی، می‌توانند کتابخانه‌های خام یا ایمن شده را حاصل کنند. انتخاب اینکه چه ایزوتیپ پادتن حاصل شود، به کاربرد کتابخانه بستگی دارد. منبع مصنوعی بطور کامل در شرایط آزمایشگاهی ساخته می‌شود و خالی از پایه‌های طبیعی و افزونگی پادتن در موجود زنده است که اجازه کنترل اطلاعات ژنتیکی و ایجاد تنوع را می‌دهد.

یک کتابخانه ایمن شده، ژن‌های پادتن را از بیمارانی که سابقا در معرض بیماری خاص یا عفونت قرار گرفته و بهبود یافته‌اند، می‌گیرد. نمونه‌های ناشی از سلول‌های B فعال که تنوع جذب آن با بلوغ موجود زنده تحت تاثیر قرار می‌گیرد و پادتن‌های طبیعی که نسبت به عفونت واکنش می‌دهند، از سلول‌های B برداشت شده‌اند. ایزوتیپ Ig که معمولا برای تولیدکتابخانه ایمنی استفاده می‌شود، IgG است، اما دیگر کتابخانه‌های ایزوتیپ مانند IgA و IgE از عوامل بیماری‌زا نظیر بیماری سلیاک و آلرژی لاتکس تولید می‌شوند. بنابراین، امکان دستیابی به پادتن‌های ضد آنتی‌ژن‌های این شرایط افزایش می‌یابد، بطوری‌که نمونه به سمت آنتی‌ژن بیماری خاص تمایل دارد. بخاطر انتخاب طبیعی پادتن‌ها برای شرایط موجود توسط سیستم ایمنی، لازم نیست که اندازه یک کتابخانه ایمن به بزرگی کتابخانه خام باشد. بنابراین دو مشخصه اصلی یک کتابخانه ایمن، جمعیت غنی شده‌ی پادتن‌های خاص آنتی‌ژن و پادتن‌های با الکترون خواهی بالا است بطوری که برخی از این پادتن‌ها الکترون خواهی را تحت تاثیر قرار می‌دهند. سختی آشکار تولید چنین کتابخانه‌هایی، دسترس‌پذیری سلول‌های B است بطوری‌که برای ایمن‌سازی انسان‌ها غیرممکن می‌باشد. برخی دیگر از مشکلات، زمان مورد نیاز برای بهبودی پس از در معرض قرار گرفتن، تحمل نسبت به سمی شدن آنتی‌ژن‌های خاص، عدم پاسخ ایمن به آنتی‌ژن‌های خودی و بیشتر از همه نیاز به تولید یک کتابخانه جدید برای یک بیماری جدید، می‌باشند.

برای ساخت کتابخانه‌های پادتن خام، معمولا از IgM mRNA سلول‌های B اهداکنندگان سالم استفاده می‌شود. مواردی وجود دارند که به موجب آن‌ها IgD بعنوان یک زیر مجموعه از خانواده Ig، بطور مشترک با IgM روی سلول‌های B استفاده شده برای تولید کتابخانه پادتن خام، بیان می‌شود. سلول‌های B، معمولا از لنفوسیت‌های خون، مغز استخوان یا لوزه‌ها ایزوله هستند. بخاطر غیر اختصاصی بودن پادتن‌ها در جمعیت‌های خام، معمولا یک کتابخانه با اندازه بزرگتر مورد نیاز است تا شانس دستیابی به پادتن‌های با الکترون خواهی بالاتر افزایش و نرخ موفقیت انتخاب در برابر توده بسیاری از آنتی‌ژن‌ها بهبود یابد. مزیت اصلی کتابخانه‌های خام، توانایی غربال برای پادتن‌های مخالف هر آنتی‌ژن است. چندین کتابخانه خام با تنوع میانگین  برای تولید موفق پادتن‌های مخالف با اهداف مختلف در محدوده‌ی آنتی‌زن‌های خودی، غیر ایمونوژنیک، سمی و هاپتن‌های شیمیایی گزارش شده‌اند. پادتن‌های تولید شده از کتابخانه‌های خام، گرایش به الکترون خواهی پایین‌تر از پادتن‌های بدست آمده از کتابخانه‌های ایمن دارند. این مساله می‌تواند با تنوع ژن‌های V از طریق تصادفی سازی CDR ها، رفع شود. کتابخانه حاصله، یک چارچوب واحد با وقوع تغییرات در تنها CDR ها را دارد. این کتابخانه، یک کتابخانه نیمه مصنوعی نامیده می‌شود چراکه چارچوب اصلی از یک کتابخانه خام مشتق شده است که بعدا در محیط آزمایشگاهی برای حصول پادتن‌های با الکترون خواهی‌های مختلف اصلاح شده است.

دسته آخر از کتابخانه پادتن، کتابخانه مصنوعی است. کتابخانه‌های پادتن مصنوعی، از اطلاعات تولید شده بصورت زیست شناختی در مورد اپیتوپهای پادتن، تعاملات پروتئین- پادتن، طراحی الکترون خواهی، الگوهای نوترکیب ژن V و پیش‌بینی‌های ساختاری نواحی مختلف، از پایین به بالا طراحی شده‌اند. مطالعات در مورد ژن‌های متغیر به طراحان کمک می‌کند تا اولویت‌های آمینواسید و تغییرپذیری الگوها در حلقه‌های فوق العاده تغییر پذیر را تعیین کنند. بطور عادی، یک چارچوب پادتن پایدار استفاده می‌شود و تصادفی سازی در نواحی CDR خاص برای ایجاد تنوع انجام می‌گیرد. از سه CDR متغیر، CDR3 از زنجیره سنگین معمولا برای ایجاد گوناگونی استفاده می‌شود و بالاترین تعامل سطحی با آنتی‌ژن‌ها را دارد. تلاش‌های زیادی به جهت بررسی نقش CDR3 زنجیره سنگین در تشخیص آنتی‌ژن انجام گرفته است. این بررسی‌ها منجر به معرفی قوانین H3 گردید که جایگزینی آمینو اسید در موقعیت‌های ویژه در CDR3 را کنترل می‌کند تا شناسایی پیشرفته ساختار سوم را ایجاد کند. فراتر از گرایشات آمینو اسید، توزیع طولی CDRها، گوناگونی‌ای که می‌تواند ایجاد شود را تحت تاثیر قرار می‌دهد. تفاوت در ساختارهای اتصالی پادتن‌ها بخاطر دسته‌های مختلف تولید شده از تفاوت توالی‌های آمینو اسید و طول هر دو زنجیره، با تنوع کتابخانه مرتبط است. همانطور که تعاملات آنتی‌ژن- پادتن برپایه پیوند اشتراکی زنجیره سبک و سنگین هستند، کار بر روی تعاملات زنجیره سبک و سنگین به طراحان در طراحی بهتر ساختارهای پادتن کمک می‌کند. با تمام این اطلاعات همراه با نوآوری‌ها در فناوری کلون کردن و جهش‌های ژنی، یک چارچوب پادتن کامل می‌تواند با درجه بالایی از خصوصیات و درستی ایجاد شود.

مزیت آشکار چنین کتابخانه‌هایی، استقلال از یک عامل ایمنی طبیعی است که اجازه‌ی تولید آسان کتابخانه‌های با تنوع بالاتر را برای فناوری‌های آزمایشگاهی می‌دهد. کتابخانه‌های مصنوعی بعنوان کتابخانه‌های خام نیز عمل می‌کنند، بنابراین به کاربر اجازه می‌دهند تا برای اهداف چندگانه بدون محدودیت کتابخانه‌های ایمن، غربالگری نماید. چارچوب‌ها می‌توانند برپایه پایداری، بیان بالا یا عدم ایجاد ایمنی که برای درمان شناسی لازم است، انتخاب شوند. با تمام این تفاسیر، استفاده از کتابخانه‌های پادتن مصنوعی در مقایسه با کتابخانه‌های خام، واقعا جا نیافتاده است. این می‌تواند ناشی از تکرار بالای توقف‌های غیرطبیعی و سایت‌های گلیکوز شده بوجود آمده در اثر تصادفی سازی باشد که می‌تواند مانع از تبدیل به مولکول‌های IgG کامل و در همان زمان از دست رفتن خواص پس از تبدیل گردد. هزینه ایجاد چنین کتابخانه‌هایی هنگفت است که آن را یک انتخاب نامناسب برای پژوهشگران کرده است. این مشکلات با کتابخانه‌های مصنوعی موجود و پژوهش‌های صورت گرفته در موسسه تحقیقات اسکریپس و انجمن تحقیقات پزشکی آشکار شده است.

–  انتخاب پادتن با تکنیک پنینگ

فرآیند انتخاب آزمایشگاهی پادتن‌ها از کتابخانه‌های پادتن بر پایه الکترون خواهی هدف، پنینگ (جفت سازی) نامیده می‌شود. این فرآیند، یک روند تکراری است که در آن جمعیت پادتن‌های هدف، متناسب با تعداد دورهای پنینگ غنی می‌شوند. برای فرآیند پنینگ، آنتی‌ژن‌های هدف در فازهای جامد بسیار متفاوتی پوشش داده می‌شوند. فازهای جامد معمول، نیترو سلولز، دانه‌های مغناطیسی، ستون‌های اگارز، ستون‌های یکپارچه (مونولیتیک)، لوله‌های پلی استایرن و صفحات میکروتیتریک 96 دیواره‌ای هستند.‌ شکل (2)، فرآیند کامل پنینیگ نمایش فاژی را نشان می‌دهد. بطور کلی، آنتی‌ژن‌های هدف بر روی سطح فاز جامد برای ارائه پوشیده می‌شوند و با ذرات فاژی پادتن از کتابخانه کشت خواهند شد. این کار از یک مرحله کشت حاصل می‌شود تا اجازه اتصال پادتن‌ها به آنتی‌ژن داده شود. در این حین، پارامترهای فیزیکی، شیمیایی یا بیولوژیکی می‌توانند تنظیم شوند. برای حذف ذرات فاژ بی قید از ذرات فاژ مقید، یک مرحله غربال‌گری مورد نیاز است که شدت آن می‌تواند کنترل شود. تغییرات در استراتژی‌های غربال‌گری می‌تواند در غنی‌سازی کلون‌های با مشخصات مختلف منتج شود. نهایتا یک مرحله پاک‌سازی با هضم آنزیمی یا انتقال PH انجام می‌گیرد. ذرات فاژ باقی مانده از طریق E. Coli تقویت می‌شوند. در همین زمان، ذرات فاژ می‌توانند برای استفاده در دور پنینگ بعدی یا برای تحلیل‌های نهایی، دوباره بسته‌بندی شوند.

شناسایی ذرات فاژ مقید پس از پنینگ انجام خواهد گرفت. این کار معمولا پس از 4 تا 6 دور پنینگ انجام می‌شود. آزمایشات پنینگ می‌توانند از طریق روش‌های پر بازده بصورت رباتیک انجام شوند. سنجش می‌تواند در شکل محلول یا پادتن‌ها یا فاژهای ارائه پادتن صورت گیرد. مناسب‌ترین روش برای ارزیابی، ELISA است. سپس کلون‌های مثبت برای دستیابی به اطلاعات ژنوتیپی مربوط به کلون مثبت، مرتب خواهند شد. با توجه به اینکه هم اکنون اطلاعات ژنتیکی کلون در دسترس است، اصلاحات در پادتن قابل انجام هستند و در میزبان‌های مختلف بسته به پلتفورمی که پادتن‌ها در آن استفاده خواهند شد، صورت می‌گیرند. دسترس پذیری اطلاعات ژنتیکی پادتن‌ها، اصلاحات اضافی از نظر پایداری و الکترون خواهی را تسهیل می‌کند.

انطباق‌پذیری فرآیند پنینگ در راه حل‌ها، شرایط و عوامل فشار مختلف، اجازه تولید پادتن‌های مخالف با ازدیاد آنتی‌ژن‌ها را می‌دهد که این کار از روش هیبریدومای مرسوم غیر ممکن بود. روش هیبریدوما به یک عامل عفونی یا سمی در میزبان حیوانی نیاز دارد تا پادتن‌های ضد آن‌ها را تولید کند. این کار کاربردی نیست، چرا که میزبان حیوانی، عفونت یا سموم را برای حصول پادتن‌های مطلوب، زنده نخواهد گذاشت. با استفاده از نمایش فاژ، پادتن‌های مخالف عامل‌های عفونی متنوع نظیر دنگی، آنفولانزا، ابولا، سیاه زخم و سایرین، بطور موفقیت آمیزی تولید می‌شوند. در برخی نمونه‌ها، ذرات ویروسی کاملی برای پنینگ استفاده ‌شده‌اند که منجر به تولید پادتن‌های مخالف با پروتئین‌های پوشش ویروسی به‌جای پروتئین‌های سلول میزبان گردیده است. روش نوترکیب اجازه تولید پادتن‌های مخالف با پروتئین‌های غشایی که نیاز به حضور زداگرها یا غشایی برای حفظ سازگاری محلی‌اش دارد را می‌دهد. این کار در حیوانات محتمل نیست، بطوری‌که اثرات تغییر ماهیت محیط سرمی، سازگاری محلی پروتئین‌ها را از بین می‌برد. بی ثباتی سازگاری پروتئین از حیوانات ایمن شده، باعث ایجاد چالش در تولید پادتن‌های مخالف با سازگاری پروتئینی خاص می‌گردد. اصلاحات در استراتژی‌های پنینگ نظیر انتخاب‌های منفی یا پنینگ با گیرنده‌های غشاء سلولی فعال، برای تولید پادتن‌های سازگار استفاده شده‌اند. توانایی کنترل و تنظیم فرآیند پنینگ برای تولید پادتن‌های بسیار خاص در برابر پروتئین‌هایی که دارای توالی بسیار مشابه با تغییرات کم هستند، بسیار مفید است که این کار با ایمنی سازی غیر ممکن می‌باشد. اصلاح پس از ترجمه نظیر سولفو تیروزین، یک اصلاح رایج است که بر حدود 30% از تمام پروتئین‌های غشایی و ترشحی اثر می‌گذارد. همانطور که یک اصلاح در ایجاد طبیعی پادتن‌های ضد سولفو تیروزین نسبتا معمول است، استفاده از ایمن سازی اگر یک کار غیر ممکن نباشد، بسیار چالش برانگیز است. با این حال، نمایش فاژ برای تولید پادتن‌های مخالف با پروتئین‌های اصلاح شده‌ی سولفو تیروزین، بطور موفقیت آمیزی استفاده می‌گردد.

شکل 2- دید کلی از فرآیندهای درگیر در انتخاب پادتن‌ها با پنینگ نمایش فاژی

– اصلاحات پادتن‌ها برای تشخیص

بکارگیری پادتن‌های مشتق شده از نمایش فاژ برای تشخیص، اجازه‌ی طراحی شکل‌های مختلف تشخیص را خواهد داد. بسته به نیاز، کیت‌های آزمایشی مطابق با مکانیزم‌های مختلفِ تعامل، طراحی شده‌اند. مزیت اصلی استفاده از پادتن‌های نوترکیب برای تشخیص، آزادی در اصلاح پادتن‌هاست. طبیعیت قویِ پادتن‌های نوترکیب باعث بکارگیری زیاد آن‌ها شده است. پلتفورم‌های بسیار مختلفی وجود دارند که بطور موفقیت آمیزی، پادتن‌های نوترکیب را برای تشخیص بکار گرفته‌اند. پلتفورم‌های تشخیص نظیر نوارهای جریان عرضی، آزمایشات مبتنی بر دانه نظیر لومینکس، یاخته‌سنجی (سایتومتری) جریان، آزمایش انعقاد نزدیکی، تصویر برداری مولکولی، فناوری تشدید، میکروفلوئیدیک و اخیرا DNAzyme، از پادتن‌های مشتق شده از نمایش فاژی بهره‌مند شده‌اند. با ظهور بیولوژی مولکولی، اصلاحات جدید بسیاری می‌توانند برای کاربردهای تشخیصی انجام شوند.

4-1- الکترون خواهی

بطور طبیعی، پادتن‌های تولید شده توسط لنفوسیت‌های B معمولا فرآیند الکترون خواهی را تحت تاثیر قرار می‌دهند. فرآیند الکترون خواهی در موجود زنده می‌تواند توسط دو مکانیزم انجام شود. جهش فوق العاده جسمی که در ژن‌های CDR ایمونوگلوبین اتفاق می‌افتد. دومی، انتخاب کلونی است که در آن سلول‌های B که SHM را تحت تاثیر قرار می‌دهند، برای دسترس‌پذیری محدود آنتی‌ژن برای گسترش، رقابت خواهند کرد. در فناوری پادتن نوترکیب، الکترون خواهی در محیط آزمایشگاهی انجام می‌گیرد. دو استراتژی اصلی برای الکترون خواهی در محیط آزمایشگاهی از پادتن‌های انتخاب شده‌ی فاژی یا مهندسی شده وجود دارد: جهش‌‌زایی‌های مستقیم در CDR انتخابی و همچنین فرآیندهای انتخابی که در آن، PCR مستعد خطا، تشعشعات و جهش‌زاهای شیمیایی، منابع اصلی برای جهش تصادفی هستند. این روش بطور خاص برای بهینه‌سازی قطعه پادتن استفاده می‌شود. بسته به طراحی سنجش توسعه داده شده، پادتن‌های با الکترون‌خواهی مختلف می‌توانند اولویت‌بندی شوند. بنابراین، توانایی اصلاح الکترون‌خواهی پادتن از طریق روش‌های آزمایشگاهی، اجازه‌ی سفارشی‌سازی پادتن در کاربردهای تشخیصی را می‌دهد.

4-2- ترکیبات آنزیم و پروتئین

یکی از فاکتورهای کلیدی موفقیت برای کاربردهای نمایش فاژی پادتن، همکاری با روش‌های غربالگری پر بازده است. اصلاحات مولکولی پادتن‌های نوترکیب اجازه‌ی ایجاد ترکیبات آنزیم- پادتن و پروتئین- پادتن را می‌دهد. این ترکیب، تقویت سیگنال را میسر می‌سازد. برخی تبدیلات رایجِ کلون‌های پادتن انتخابی، ترکیب با آنزیم‌ها نظیر آلکالین فسفاتاز و هورس‌رادیش پروکسیداز برای تسهیل پیشرفت سیگنال هستند. این روش اجازه‌ی تشخیص مستقیم بدون نیاز به فرآیندهای ترکیبی شیمیایی را می‌دهد که برای تولید با قابلیت تکرار و بازده بالاتر، مقرون به‌صرفه خواهد بود. در کنار ترکیب آنزیم، پروتئین‌ها نیز بطور موثری با پادتن ترکیب می‌شوند. رایج‌ترین آن‌ها ترکیبات پروتئین فلورسنت نظیر فلوروبادی‌ها هستند که بطور گسترده برای تشخیص پادتن نوترکیب استفاده می‌شود، بطوری‌که بدون نیاز به تصویر برداری شیمیایی، سریع و مستقیم است. این پادتن‌ها می‌توانند برای میکروسکوپی فلورسنت، مرتب‌سازی سلول و حتی آسیب‌شناسی بافت بکار گرفته شوند.

4-3- برچسب‌های پپتید

برچسب‌های پپتید بطور مداوم در بیولوژی مولکولی بخصوص در سیستم‌های بیان پروتئین نوترکیب و قالبا برای تصفیه، استفاده می‌شوند. همین نقش نیز می‌تواند برای استفاده آن‌ها در پادتن‌های نمایش فاژ نیز بیان شود که به موجب آن، برچسب‌های پپتید نظیر برچسب 6 هیستیدین برای سهولت تصفیه و تشخیص پادتن‌ها استفاده می‌شود. این کار برای فرآیند تولید کیت‌های تشخیص ضروری است بطوری‌که پادتن‌های با خلوص و بازده بالا مورد نیاز هستند. با این حال، برچسب‌های پپتید دیگر نظیر برچسب Myc بطور گسترده بعنوان روشی برای پیشرفت سیگنال استفاده شده است. کاربرد دیگر مربوط به تشخیص، استفاده از پادتن‌های با برچسب SNAP برای پیوند کوالانسی پادتن‌ها به فاز جامد است. همچنین، امکان ارائه یک توالی پپتید خاص نظیر برچسب AVI برای آماده‌سازی بیوتینیل کردن آنزیمی قطعه Fab در محیط آزمایشگاهی با استفاده از بیوتین لیگاز، بیوتین و ATP وجود دارد. معرفی برچسب‌های پپتید متنوع برای تصفیه و اتصال یا پیشرفت سیگنال، تنها با استفاده از پادتن‌های نوترکیب ممکن است.

4-4- عملیاتی‌سازی DNA

عملیاتی سازی مستقیم DNA، اخیرا برای ساختن هیبرید‌های DNA پروتئین بکار برده شده است. چنین فناوری‌ای برای بکارگیری در توسعه آرایه‌های پادتن، بطور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. یک ایمونوگولوبین برچسب‌گذاری شده توسط DNA استاندارد، می‌تواند در سطحی که مکمل الیگونوکلئوتیدها را حمل می‌کند، بی‌تحرک شود. کاربرد پادتن‌های با DNA عملیاتی شده، در سنجش‌های تشخیصی نظیر سنجش dot-blot است که در آن، تولید مولکول‌های هیبرید DNA – پادتن در آنتی‌ژن‌های خاص برای تشخیص آسان می‌باشد. در برخی نوشتارها، آرایه ریز نقطه روش دیگری است که در آن تشخیص بیومارکر (زیست نشانگر) پروتئین با تشخیص اسید نوکلئیک ترکیب می‌شود. مزیت ترکیب دو روش آن است که پروب‌ها می‌توانند بر اساس هدف ناشی از هیبریداسیون DNA طراحی شوند. الصاق مولکول‌های DNA به تقویت سیگنال نیز کمک می‌کند. روش‌های نوآورانه‌ی با حساسیت بالاتر نظیر ایمونو PCR و ایمونو RCA، کاربرد موفقیت‌آمیزی برای تشخیص داشته‌اند. هر دو روش از مفهوم یکسان تقویت مولکول‌های DNA الصاقی برای افزایش میزان تولید سیگنال استفاده می‌کنند. ایمونو PCR از واکنش زنجیره پلیمراز مرسوم برای تکثیر DNA استفاده می‌کند درحالی‌که ایمونو RCA از تقویت ایزوترمال برای افزایش DNA استفاده می‌کند.

5- جمع‌بندی

روش‌های تشخیص موجود، چالش زیادی بخصوص برای تشخیص بیماری‌های عفونی دارند. این امر، ضرورت تولید پادتن‌های باکیفیت برای تشخیص را افزایش می‌دهد بطوری‌که درصد زیادی از پادتن‌های تجاری ویژگی‌های ضعیف و شکست در تشخیص اهداف را نشان می‌دهند یا تمام موارد مدنظر با یکدیگر در دسترس نیستند. سرعت در فناوری‌های ژنومیک و پروتئومیک، تولیدکنندگان پادتن‌ها را با مشکل مواجه کرده است. این افزایش باعث شده تا روش‌های هیبریدوما توانایی تامین نیازها را نداشته باشد. بنابراین، ظهور روش‌های آزمایشگاهی نظیر نمایش فاژ، راهی برای تامین نیازهای تشخیص برای پادتن‌های بهتر و جدید ایجاد کرده است. همگام با معرفی فناوری‌های جدید مانند توالی نسل بعد، رباتیک و فناوری نانو، غربال‌گری‌های پر بازده‌ی کتابخانه‌های نمایش فاژ برای تولید سریع پادتن، هم‌اکنون به وقوع پیوسته است. به‌علاوه، فناوری‌های جدید مولکول محور برای تولید کتابخانه و استراتژی‌های پنینگ، پالس‌هایی برای بهبود مداوم نمایش فاژی در تولید پادتن برای تشخیص، ارسال می‌کند. با افزایش کشف ژنومیک و پرومئوتیک‌های مشتق شده از بیومارکرها، نمایش فاژ پادتن‌ها، نقش پر رنگ‌تری در آینده‌ی تشخیص ایفا می‌کنند.

References

[1] Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

predefined specificity. Nature 1975;256:495e7.

[2] Schirrmann T, Meyer T, Schütte M, Frenzel A, Hust M. Phage display for the

generation of antibodies for proteome research, diagnostics and therapy.

Molecules 2011;16:412e26.