فهرست مطالب
مقدمه
با گسترش و توسعه روز افزون فناوریهای زیستی، بالطبع، نیاز به فراگیری تکنیک های مرتبط با این رشته نیز افزایش مییابد
cDNA چیست؟
همانطور که میدانیم نواحی مشخصی در اکثر ژنها وجود دارند؛ به نام نواحی اگزونی و اینترونی. حال محققان برای بررسی نواحی اگزونی و کد کننده یک ژن باید نواحی اینترونی و سایر نقاطی از ژن که کد کننده نیستند را حذف کنند.
ساخته میشود که فاقدmRNA، رشتهی DNAدر رونویسی خواندیم که از روی رشته نواحی اینترونی میباشد.
DNA را به mRNA، رونوشت RNAحال زیست شناسان با استفاده از نوعی پلیمراز وابسته به تبدیل میکنند. که فاقد نواحی غیرنیاز است.
به چه از آن منظور استفاده میشود؟
از این تکنیک به طورگسترده در:
الف) مهندسی ژنتیک
ب) توالی یابی
ج) تهیه پروب
و … استفاده میشود
برای انجام این تکنیک پروتکلهای متفاوتی وجود دارد؛ ولی در ادامه سعی شده است که در5 مرحله، نوع مرسوم آن توضیح داده شود.
1. آماده سازی نمونه
در نمونهی تهیه شده میپردازیم. روشهای مختلفی وجود داردRNAطی این مرحله به خالص سازی که از جمله آنها سانتریفوژ در شیب چگالی کلرید سزیم میباشد. را ایجاد میکنند، پاکسازیRNAدقت شود که محلولمان باید از هر گونه موادی که امکان آسیب به شود، زیرا این رشته بسیار ناپایدار و واکنش پذیر است.
2. پاک کردن نمونه از یDNA
دو روش وجود دارد:
الف) تیمار با آنزیم
RNA ژنومی پاکسازی میکند ولی بدلیل احتمال آسیب به DNAاین روش مرسوم بوده و نمونه را از کمتر مورد استفاده قرار میگیرد.
ب) تیمار با آنزیم اختصاصی
این روش از لحاظ کیفیت و زمان انجام مراحل مرسوم بوده و مورد استفاده قرار میگیرد.
3. انتخاب آنزیم
وجود دارند، همچنین نوع خاص و مهندسی شدهای MMLV وAMVدو آنزیم بسیار معروف وجود دارد که شرایط بهینهتری را ارائه میدهد. در جدول زیر خصوصیات هرکدام ذکر شده است:
4. میکس کردن واکنشگرها
در این مرحله مواد لازم برای انجام در یک میکروتیوب ریخته میشود و آماده آزمایش خواهد شد. میزان هرکدام از مواد زیر طبق پروتکلهای مربوط به واکنش تعیین میشود و در اختیار فرد آزمایش کننده قرار میگیرد.
5. شروع سنتز
این مرحله بر حسب نوع پرایمر و پلیمرازی که انتخاب شده است متفاوت می باشد. مهمترین بخش این مرحله پلیمریزاسیون می باشد که باید برای افزایش اختصاصیت، در دمایبهینه آنزیم صورت بگیرد.
نتیجه
رشته مورد نظر سنتز شده است و میتوان تعیین غلظت نمود و سپس در ترموسایکلر رشته مورد نظر را تکثیر داد. این تکنیک بسیار مهم و کاربردی است.
نویسنده: محمد امین قلاوند
منابع:
- https://scholarworks.iu.edu/dspace/bitstream/handle/2022/15400/Molecular_cDNAsynthesis.pdf?sequence=1
- https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/pcr/reverse-transcription/5steps-cDNA.html
- https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/brochures/rna-isolation-purification-brochure.pdf
یک نظر