تکنیک های تقویت و تشخیص اسید نوکلئیک

امروزه تکنیک‌های تقویت و تشخیص اسید

نوکلئیک یکی از ارزشمندترین ابزارهای در

تحقیقات بیولوژیکی است.

دانشمندان در تمام زمینه‌های علوم زندگی،

تحقیقات اولیه، بیوتکنولوژی، پزشکی، پزشکی

قانونی، تشخیص و موارد دیگر از این روش‌ها

در طیف گسترده‌ای از برنامه‌ها استفاده می‌کنند.

برای برخی از کاربردها، تشخیص کیفی اسید

نوکلئیک کافی است. با این حال، سایر

برنامه‌ها نیاز به تجزیه و تحلیل کمی دارند.

انتخاب بهترین روش برای برنامه شما نیاز

به دانش گسترده ای از این فناوری دارد.

آشنایی با دستگاه

ظهور real time pcr و رونویسی معکوس

real time pcr نحوه اندازه گیری بیان ژن

را به طرز چشمگیری تغییر داده است.

pcr real time یک روش جمع آوری داده‌ها

در طول فرآیند PCR است، بنابراین تقویت

و تشخیص را در یک مرحله ترکیب می‌کند.

این امر با استفاده از انواع مختلف شیمیایی

فلورسنت که غلظت محصول PCR را با

شدت فلورسانس مرتبط می‌کند به دست می‌آید.

واکنش‌ها با یک نقطه زمانی (یا چرخه PCR)

مشخص می‌شوند که در آن ابتدا تقویت

کننده هدف شناسایی می‌شود.

این مقدار معمولاً به عنوان آستانه چرخه

شناخته می‌شود، هنگامی که شدت فلورسانس

بیشتر از فلورسانس پس زمینه است.

در نتیجه، هرچه مقدار DNA هدف در

مواد اولیه بیشتر باشد، افزایش چشمگیر

سیگنال فلورسنت سریعتر ظاهر می‌شود

و چرخه پایین‌تر.

دستگاه Real time PCR

تشخیص زمان واقعی محصولات PCR

با گنجاندن یک مولکول گزارشگر فلورسنت،

در هر جای واکنش که باعث افزایش

فلورسانس با افزایش مقدار DNA محصول

می‌شود، فعال می‌شود.

مواد شیمیایی فلورسانس مورد استفاده

برای این منظور شامل رنگ‌های متصل به

DNA و آغازگرها یا پروبهای مخصوص

توالی هستند.

سیکلرهای حرارتی تخصصی مجهز به

ماژول‌های تشخیص فلورسانس برای نظارت

بر سیگنال فلورسانس در هنگام تقویت

استفاده می‌شود.

فلورسانس اندازه‌گیری شده، متناسب با

مقدار کل آمپلیکون است.

از تغییر فلورسانس در طول زمان برای

محاسبه مقدار آمپلیکون تولید شده در

هر چرخه استفاده می‌شود.

روش real time pcr

استفاده از روش real time pcr مزایای زیادی

نسبت به روش‌های دیگر برای تعیین بیان ژن دارد.

روش‌های real time pcr 10000 تا

100000 برابر حساس تر از روش‌های

حفاظتی RNase (4) ، 1000 برابر حساس‌تر

از هیبریداسیون نقطه‌ای هستند و حتی

می‌توانند یک نسخه واحد از رونویسی خاص

را تشخیص دهند.

علاوه بر این، اندازه گیری زمان واقعی

PCR می‌تواند تفاوت بیان ژن را بین نمونه‌ها

و ضرایب تغییرات کمتر به طور قابل اعتماد

تشخیص دهد.

آنالیز داده‌ها و تفسیر نتایج دستگاهReal time PCR 

مانند تراکم سنجی باند (44.9)) و هیبریداسیون

پروب (45.1)) PCR real time همچنین

می‌تواند بین RNAهای پیام‌رسان (mRNAs)

در توالی تقریباً یکسان تمایز قائل شود،

و نسبت به سایر روش‌های تجزیه و تحلیل

بیان ژن به الگوی RNA بسیار کمتری نیاز دارد

و با تجهیزات مناسب می‌تواند نسبتاً دارای

قدرت بالایی باشد.

مهمترین عیب PCR real time چیست ؟

مهمترین عیب PCR real time این است که

به تجهیزات و معرف‌های گران قیمت نیاز دارد.

علاوه بر این، به دلیل حساسیت فوق العاده

بالا، طراحی تجربی سالم و درک عمیقااستفاده

می‌شود.

نتیجه‌گیری

 از روشpcr real time مزایای زیادی نسبت

به روش‌های دیگر برای تعیین بیان ژن دارد.

علاوه بر این، اندازه گیری زمان واقعی PCR

می‌تواند تفاوت بیان ژن را بین نمونه‌ها و

ضرایب تغییرات کمتر به طور قابل اعتماد

تشخیص دهد تکنیک‌های نرمال سازی، برای

نتیجه گیری دقیق ضروری است.

مائده فراهانی

منبع