روش توالی‌ یابی (Illumina (Solexa

توالی یابی

امروزه تعیین توالی DNA به یکی از مهم‌ترین تکنیک‌های موجود در زمینه زیست شناسی مولکولی تبدیل شده است. در این روش می‌توان ترتیب قرار گرفتن نوکلئوتیدها را در یک قطعه از DNA مشخص نمود. توالی‌یابی ممکن است برای تعیین توالی ژن‌های خاص، مناطق بزرگ ژنومی، کل کروموزوم و کل ژنوم به کار برده شود. امروزه توالی‌یابی DNA یک تکنیک بسیار کاربردی در آزمایشگاه است. روش‌های سنتی توالی‌ یابی زمان‌بر و گران هستند و دیگر پاسخگوی تحقیقات گسترده دانشمندان نیستند.

به طور کلی روش‌های تعیین توالی DNA به سه نسل اول، دوم و سوم تقسیم بندی می‌شوند که در ادامه به تفکیک توضیح داده می‌شود.

نسل اول توالی‌ یابی

به طور کلی نسل اول توالی‌ یابی‌های DNA به دو روش ختم زنجیره و هضم شیمیایی یا ماکسام گیلبرت تقسیم بندی می‌شوند؛ هر دو روش نیازمند ژل پلی آکریل آمید به منظور مرئی سازی قطعات تولید شده و تعیین توالی است.

نسل دوم توالی‌ یابی

با ظهور علومی مانند نانوتکنولوژی و بیوانفورماتیک، روش‌های جایگزینی جهت افزایش سرعت و افزایش بازدهی تعیین توالی DNA ابداع شده است که Next Generation Sequencing نامیده شد. این تکنیک‌ها نیازی به ژل و کلونینگ ندارند و از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز جهت ازدیاد قطعات استفاده می‌کنند. در نتیجه سرعت و بازدهی بالایی دارند.

نسل سوم توالی‌ یابی

تعیین توالی نسل سوم، روی مولکول DNA منفرد انجام می‌شود و نیازی به واکنش PCR برای آماده سازی نمونه نیست. همچنین طول قطعات در حدود 8-6 کیلوباز می‌باشد که بسیار بلندتر از طول توالی خوانده شده سایر روش‌های NGS است. طول بلندتر قطعات، کاهش زمان و هزینه و خطای خوانش را در پی دارد. در تکنیک‌های نسل سوم نیازی به تکثیر قطعات DNA نیست. این تکنیک‌ها به SMS یا single molecule sequencing نیز معروف هستند و اولین بار توسط Stephen Quake پایه ریزی شدند ودر نهایت توسط شرکت Helicos BioSciences تجاری سازی شدند.

روش توالی‌ یابی (Illumina (Solexa

این تکنیک توسط شرکت Illumina در سال 2007 ارائه گردید و دستگاه hiseq 2500 یکی از کاربردی‌ترین دستگاه ها برای انجام این تکنیک می‌باشد. در این تکنیک به جای تکثیر به واسطه  emPCR یا bead-based emPCR از ملکول‌های آداپتوری استفاده شد که روی یک سطح جامد ثابت شده بودند. روند کار به این صورت است که در ابتدا ژنوم مورد نظر به قطعات DNA صد تا 150 جفت بازی شکسته می‌شود؛ سپس به دو انتهای هر قطعه آداپتور متصل می‌شود و قطعات، تک رشته‌ای می‌شوند؛ قطعات به‌صورت تصادفی روی سطح جامدی که با توالی‌های مکمل آداپتور پوشیده شده است، توزیع می‌شوند در نتیجه هر قطعه از DNA بر روی سطح جامد ثابت می‌شود.

در مرحله بعد انتهای آزاد این قطعات نیز به توالی‌های مکمل آداپتور متصل شده و یک پل تشکیل می‌دهند؛ سپس تکثیر این پل با افزودن مواد مورد نیاز PCR آغاز می‌شود که در اصطلاح به این فرآیند، bridge amplification یا  Bridge PCR گفته می‌شود. توالی‌های مکمل آداپتور نقش پرایمر دارند؛ پس از پایان هر سیکل، DNA دو رشته‌ای حاصل دناتوره شده تا دوباره PCR انجام گیرد. این واکنش تا زمانی که تعداد زیادی از قطعه مورد نظر ایجاد شود، تکرار می‌شود. هدف، افزایش تعداد قطعه مورد نظر به منظور تقویت شدت سیگنال می‌باشد.

Denaturation

از آنجا که این تکنیک نیز نیازمند DNA تک رشته به عنوان الگو می‌باشد، پس از اتمام مرحله تکثیر، محصولات PCR باید دناتوره شوند. در این حالت ست‌هایی در حدود 1000 کپی از DNA تک رشته به‌صورت تصادفی بر روی سطح جامد ایجاد می‌شود که به هر کدام DNA Polony گفته می‌شود. هر پلونی حاوی یک قطعه DNA می‌باشد. در این روش حداقل 40 میلیون پلونی به طور همزمان تعیین توالی می‌شود. جهت تعیین توالی هر پلونی، مواد مورد نیاز برای واکنش PCR شامل پرایمر، نوکلئوتیدهای ختم دهنده و DNA پلیمراز، به سطح صفحات جامد اضافه می‌شود.پرایمرهای مورد استفاده، مکمل توالی‌های آداپتور هستند.

نوکلئوتیدهای ختم دهنده

در این تکنیک از از نوکلئوتیدهای ختم دهنده به نام  3′-blocked reversible terminator nucleotides استفاده می‌شود. هر کدام از این نوکلئوتیدها، با یکی از 4 رنگ فلورسانس (سبز، قرمز، آبی و نارنجی) لیبل می‌شوند. برخلاف ddNTPهای مورد استفاده در تکنیک سنگر، این نوکلئوتیدها خاصیت برگشت‌پذیری دارند؛به این معنی که پس از اینکه لیبل رنگی آن‌ها به واسطه detector شناسایی شد، پلیمریزاسیون رشته ادامه می‌‌یابد و متوقف نمی‌شود. زیرا پس از آزاد شدن لیبل رنگی گروه terminator که انتهای ′3 این نوکلئوتیدها را بلوکه کرده نیز جدا می‌شود و در نتیجه اثر مهاری آن برداشته شده و گروه 3′-OH نمایان می‌شود. در نتیجه تکثیر رشته در حال سنتز ادامه می‌یابد.

در حقیقت نقش این نوکلئوتیدهای ختم دهنده ایجاد یک وقفه کوتاه در تکثیر رشته در حال سنتز جهت شناسایی لیبل رنگی آن و در نتیجه مشخص شدن نوع آن نوکلئوتید جهت تعیین توالی می‌باشد. در این تکنیک نوکلئوتیدها، به صورت همزمان به مخلوط واکنش در هر مرحله اضافه می‌شود و بر اساس لیبل‌های فلورسانس متفاوتی که دارند از یکدیگر متمایز می‌شوند. همچنین در روش Solexa، پس از اتمام هر مرحله به منظور حذف نوکلئوتیدهایی که در زنجیره در محل ساخت وارد نشده‌اند یک شستشو انجام می‌گیرد سپس مرحله بعدی آغاز می‌شود.

قدرت و کارایی ژنومیک در مقیاس بزرگ

سیستم HiSeq 2500 یک سیستم قدرتمند تنظیم توالی بالا است. داده های با کیفیت بالا و با استفاده از شیمی اثبات شده Illumina SBS ، آن را به ابزاری برای مراکز مهم ژنوم و موسسات تحقیقاتی در سراسر جهان تبدیل کرده است.

انعطاف پذیری برای برنامه های چندگانه سیستم HiSeq 2500 دارای دو حالت اجرا، حالت سریع اجرا و خروجی زیاد و قابلیت پردازش همزمان یک یا دو سلول جریان است. این یک بستر انعطاف پذیر و مقیاس پذیر را فراهم می کند که طیف گسترده ای از برنامه ها و اندازه های مطالعه را پشتیبانی می کند.

بین حالت های سریع اجرا و خروجی بالا متناسب با نیازهای پروژه شما یکی را انتخاب می کنید. حالت سریع اجرا نتایج سریع را ارائه می دهد، به پردازش کارآمد تعداد محدودی از نمونه ها اجازه می دهد و از 250 جفت پایه پایان زوج طولانی تر پشتیبانی می کند. خواندن طولانی تر باعث افزایش عمق بیشتر پوشش، مونتاژ بهبود یافته برای برنامه های کاربردی de novo و کمک به برنامه های طولانی مدت مانند آنالیز متاگانومیک می شود.

حالت خروجی بالا برای مطالعات بزرگتر یا در صورت نیاز به بیشترین عمق پوشش ایده آل است. حالت خروجی بالا به شما امکان می دهد تا بیش از 6 × نمونه بیش از حالت سریع، مراحل بیشتری را انجام دهید و پروژه های بزرگ را به سرعت و کارآمد انجام دهید. HiSeq SBS Kits v4 4 میلیارد خوشه در هر بار تولید می کند و حداکثر 1 سرب داده را در 6 روز تولید می کند.

 شروع از کار

انعطاف پذیری برای برنامه های چندگانه

جریان کار

۱.مرحله مقدماتی:

برای تهیه کتابخانه های ترتیب توالی DNA یا RNA به جریان های کاری بهینه دسترسی پیدا کنید.

۲.توالی:

به راحتی بین زمان چرخش سریع و حالتهای خروجی بالا جا به جا شوید تا متناسب با نیازهای تحقیقاتی خود استفاده کنید.

۳.تجزیه و تحلیل:

به سرعت از داده های خام به نتایج معنی دار با مجموعه ای از ابزارهای تحلیلی بروید.

۴.اشتراک گذاری:

ذخیره و به اشتراک گذاری داده ها با همکاران.

گردآورنده: الهام بختیاری

منابع:

1. https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/hiseq-2500.html
2. https://zist-fan.ir/biopedia/%D8%AA%DA%A9%D9%86%DB%8C%DA%A9-%D9%87%D8%A7-%D9%88-%DA%A9%D8%A7%D8%B1%D8%A8%D8%B1%D8%AF%D9%87%D8%A7%DB%8C-%D8%AA%D9%88%D8%A7%D9%84%DB%8C-%DB%8C%D8%A7%D8%A8%DB%8C/