فهرست مطالب
مقدمه
امروزه با توجه به پژوهشهای علمی، در حوزه دانش بشری باعث ایجاد تحولات و در نهایت رسیدن به فرآورده های بدیع و نو شده است میباشد که در سال 1983 اولین بار PCRیکی از روشهای نوین که امروزه کاربرد زیادی دارد توسط مولیزابداع شد، با این کشف بیولوژی تحولات بسیاری یافت و تحقیقات بیولوژی، پزشکی ودامپزشکی در خصوص دی ان ای به سرعت افزایش یافت. یک روش آزمایشگاهی خارج از بدن می باشد که قطعه خاصی از دی ان ای را تکثیر می کند. PCR لذا برای انجام این آزمایش نیاز به مولکول دو رشته ای دی ان ای داریم که این مولکول باید از نمونههای موجود ( خون ، بافت ، انگل ،اسکولکس ،جفت ،عوامل بیماری زا و… ) استخراج شود. در آزمایشگاه روشهای مختلفی برای استخراج دی ان ای وجود دارد.
شرح آزمایش
در ابتدا بهتر است تا با هم ساختمان DNA را بشناسیم:
در سال 1953 ساختمان مارپیچ دو رشته ای دی ان ای توسط واتسون و کریک DNAساختمان مشخص شد و کلیه خصوصیات آن در حد مولکول قابل تفسیر گردید و اثر مواد موتاژن (جهش زا ) نیز در آن معلوم شد. مسئول توارث است و ترتیب اسید آمینه را در پروتئین تنظیم می کند؛ مهم ترین خصوصیت آن DNA ساختمان مارپیچ دو رشته ای می باشد که در دو رشته باریک و بسیار طولانی مانند طناب دور هم پیچیده اند. قطر مارپیچ در حدود 20 آنگستروم و در هر34 آنگستروم یک دور کامل می زند؛ هر زنجیره آن از تعداد بیشماری نوکلئوتید به هم متصل شده، ساخته شده است.
هر نوکلئوتید در دی ان ای از یک قند 5 کربنه دی اکسی ریبوز، یک باز آلی (پورین یا پریمیدین ) و یک گروه
فسفر تشکیل شده است . دو زنجیره آن به وسیله پیوند های هیدروژنی متعدد که بین بازها ایجاد می شود به هم متصل میشوند. آنچه در این ساختمان مهم است اینکه باز های آدنونین و تیمین با دو پیوند هیدروژنی و بازهای سیتوزین و گوانین با سه پیوند هیدروژنی به هم تصل میشوند.
روش های تلخیصDNA
نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژیکی مولکولی ضرورت جداسازی دی ان ای با کیفیت عالی است. ، لیپید و سایر (RNA)معمولا کیفیت دی ان ای را با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی از آر ان ای ساختار هایی که برای آنزیم های برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد می کنند سنجیده میشود.
به علت بزرگ بودن مولکول دی ان ای، روشهای استخراجی باید حداقل استرس مکانیکی را در طی مراحل استخراج ایجاد نماید. معمولا روش هایی که در آن چندین شوینده همچون SDS و TRITON استفاده می شود، نقش آن ها لیز نمودن سلول و کمک به از بین بردن پروتئین متصل به DNA میباشد. پروتئین زدایی بیشتر از طریق پروتئاز K صورت میگیرد که این ماده در بافر لیز کننده مورد استفاده قرار میگیرد. این آنزیم در حضور SDS در دمای 65- 56 درجه سانتی گراد فعالیت دارد. تحت این شرایط پروتئین بهتر واسرشت میشود. برعکس در همین شرایط آنزیم های DNAase دناتوره میشود. در ادامه استفاده از پروتئیناز k ایزوپروپانول برای از بین بردن موثر پروتئین ها استفاده میشود. باقیمانده پروتئین و لیپید هم به طور موثر از طریق کاربرد فنل و کلروفرم از بین میرود .
آلودگی RNA از طریق تیمار کردن نمونه با RNAase از بین میرود. در برخی از روش ها بعد از پروتئیناز، از نمک اشباع برای رفع آلودگی پروتئین استفاده میشود. شیوه هایی که جهت خالص سازی دی ان ای مورد استفاده قرار میگیرند علاوه بر زمان کم روش مطمئنی برای حذف بازدارندههای (inhibiators) و خالص نمودن کلیه اسیدهای نوکلئیک هم میباشند. این بازدارندهها (ممانعت کنندهها) گوناگون بوده و با توجه به نوع نمونه متفاوت میباشد. در صورتی که خالص سازی از کیفیت پایین برخوردار باشد، به علت اثر مهارکنندگی مواد موجود در نمونهها و یا مواد استفاده شده در مراحل خالص سازی، بر فعالیت پلیمراز اثر گذاشته و نتیجه تست منفی کاذب خواهد بود.
دستورالعمل استخراج DNA با پشتوانه ای از علم بیوشیمی همراه است و درک عملکرد هر یک از مواد باعث میشود که در صورت نبود یک ماده از ماده ای با کار مشابه استفاده شود.
روش جوشاندن Boiling
1.بافر لیز کننده گلبولهای قرمز که شامل این مواد می باشد :
- باز تریس 10 میلی مولار پی اچ 7.5
- ساکارز 32% مولار
- کلرید منیزیم 10میلی مولار
- تریتون 1%
2.محلول(1) : هیدروکسید سدیم 50 میلی مولار
3.محلول(2) : بازتریس 1 مولار
روش انجام کار:
نیم میلی لیتر خون فاقد هپارین را در میکروتیوب ریخته و به آن یک میلی لیتر بافر اضافه میکنیم و خوب مخلوط میکنیم. سپس به مدت دو دقیقه با شدت 1000 دور آن را در سانتریفیوژ قرار میدهیم و بعد محلول رویی که حاوی گلبولهای قرمز لیز شده و پلاسمای خون میباشد را دور ریخته و مجددا حدود 200 میکرولیتر محلول بافر را به میکروتیوب اضافه میکنیم و هم میزنیم تا رسوب موجود در آن به رنگ سفید درآید و مجددا با شدت 1000 دور در دقیقه در سانتریفیوژ قرار میدهیم.
در مرحله بعد 100 میکرولیتر محلول (1) را بر روی رسوب ریخته آنقدر هم میزنیم تا رسوب حل شود. سپس میکروتیوبها را به مدت 20 دقیقه در آب جوش قرار داده تا گلبولهای سفید لیز شوند. در آخرین مرحله 20 میکرولیتر محلول (2) را به میکروتیوب اضافه میکنیم (این محلول باعث نگهداری و حفاظت از دی ان ای در محلول میشود ) و هم میزنیم و سپس به مدت 20 الی 30 ثانیه با دور 1000 در سانتریفیوژ قرار میدهیم و در نهایت محلول رویی که حاوی دی ان ای میباشد را با احتیاط به یک میکروتیوب جدید منتقل میکنیم و سپس دی ان ای را با اتانول مطلق رسوب میدهیم.
درباره این روش بدانیم…
روش جوشاندن دارای معایب و محاسن متعددی است. این روش اصولا دارای مرحله ای تحت عنوان خالص سازی نمیباشد ، بلکه توانایی آن از این نظر مهم میباشد که می تواند دی ان ای را در دسترس قراردهد. علاوه بر آن مواد مصرفی آن کم بوده و در زمان کوتاهی امکان کار با نمونههای انبوه وجود دارد و آلودگی در آزمایشگاه کمتر خواهد بود.
از معایب این روش هم عدم حذف کامل مهار کنندهها می باشد و دیگر اینکه روش جوشاندن قادر به استفاده از نمونههای با مقادیر کم دی ان ای نمیباشد. با وجود معایب آن، به دلیل سرعت مطلوبی که دارد در آزمایشگاههای تشخیص طبی که از روش PCR استفاده میگردد برای آماده نمودن دی ان ای از آن استفاده میشود. با استفاده از این روش میتوان به آسانی از خون تازه ، لخته شده ، کهنه و خشک شده و همچنین عوامل بیماریزا دی ان ای استخراج کرد .
گردآوری: مهدیه بازدار
منبع: برگرفته از مقاله روش های آزمایشگاهی استخراج دی ان ای تالیف مهندس حسن کامکار