آنزیم‌های محدود‌کننده از تاریخچه تا صنعت

آنزیم‌های محدود‌کننده یا “Restriction enzymes” چیستند؟

آنزیم‌های محدود‌کننده یا اندونوکلئازهای محدودکننده، پروتئینی جدا شده از باکتری هستند که توالی‌های DNA را در مکان‌های توالی خاص می‌شکافد و قطعات DNA با یک توالی شناخته‌شده در هر انتها تولید می‌کند. حداقل سه‌هزار مورد از این آنزیم‌ها وجود دارد که هریک از آن‌ها توالی DNA خاصی را برش می‌دهند و تفاوتی ندارد که DNA از باکتری، قارچ، موش، انسان و… باشد. استفاده از آنزیم‌های محدودکننده برای برخی روش‌های آزمایشگاهی، از جمله فناوری DNA نوترکیب و مهندسی ژنتیک حیاتی است.

آنزیم‌های محدود‌کننده در پروکاریوت‌ها وجود دارند. عملکرد اندونوکلئازهای محدودکننده به‌طورعمده محافظت در برابر مواد ژنتیکی خارجی به‌ویژه در برابر DNA باکتریوفاژ است. عملکردهای دیگری که به این آنزیم‌ها نسبت داده می‌شود، نوترکیبی و جابه‌جایی است. هر آنزیم محدودکننده یک توالی خاص از 4 تا 8 نوکلئوتید را در DNA تشخیص می‌دهد و در این مکان‌ها می‌شکافد. اندونوکلئاز‌های جدا شده توسط ارگانیسم‌های مختلف با مکان‌های شناسایی یکسان، “Isoschizomers” نامیده می‌شوند.

تاریخچه‌ی آنزیم‌های محدود‌کننده

در اوایل دهه‌ی 1950 آزمایشات انجام شده‌ی دو گروه از محققین نشان داد که برخی سویه‌های باکتری‌ها نسبت به سایر سویه‌ها در برابر عفونت‌های ویروسی مقاوم‌تر‌ اند. ویروس‌هایی که سلول‌های باکتریایی را آلوده می‌کنند، باکتریوفاژ نامیده می‌شوند. هدف اصلی این محققین تولید باکتریوفاژهای بیشتر با تزریق ژنوم آن‌ها به باکتری میزبان بود. در این روش محققین از باکتری میزبان به‌عنوان دستگاهی برای کپی ژنوم و بیان ژن باکتریوفاژها استفاده کردند.

پس از آن، محققین دریافتند که برخی گونه‌های باکتری‌ نسبت‌به سایرگونه‌ها، در برابر عفونت‌های باکتریوفاژها و ربوده شدن ژنوم‌ آن‌ها توسط باکتریوفاژ‌ها از خود مقاومت بیشتری نشان می‌دهند. نگاهی عمیق‌تر به مکانیسم‌های دفاع از خود این باکتری‌های مقاوم به باکتریوفاژ، سلاح مخفی آن‌ها یعنی گروهی از آنزیم‌ها به نام اندونوکلئازهای محدودکننده یا آنزیم‌های محدود‌کننده را نشان داد. کشف آنزیم‌های محدود‌کننده با یک فرضیه آغاز شد. در دهه 1960، «ورنر آربر» تغییر چشم‌گیری را در DNA باکتریوفاژ پس از حمله به این سویه‌های مقاوم باکتری یعنی تجزیه و تکه‌تکه‌شدن DNA باکتریوفاژها مشاهده کرد.

پس از کشف آنزیم‌های محدود‌کننده، آربر برای توضیح اینکه چگونه این آنزیم‌های محدود‌کننده فقط به DNA باکتریوفاژها آسیب می‌زنند و باعث تخریب ژنوم خود باکتری نمی‌شوند، تحقیقات گسترده‌ای انجام داد. او فرض کرد که سلول‌های باکتریایی ممکن است دو نوع آنزیم را بیان کنند: یک آنزیم محدودکننده که DNA باکتریوفاژ خارجی را شناسایی و قطع می‌کند و دیگری آنزیم اصلاح‌کننده‌ای که DNA باکتری را شناسایی و اصلاح می‌کند تا از فعالیت تجزیه‌کننده DNA آنزیم محدودکننده خودش محافظت کند. او پیش‌بینی کرد که آنزیم محدودکننده و آنزیم اصلاحی روی یک توالی DNA به نام توالی تشخیص عمل می‌کنند. به این ترتیب، مکانیسم دفاعی خود سلول باکتری که به‌طور تهاجمی DNA باکتریوفاژ مهاجم را تخریب می‌کند، از DNA خود نیز در برابر تخریب محافظت می‌کند.

 چند سال بعد، در سال 1970، محقق دیگری به ‌نام «همیلتون اسمیت» نه‌تنها به‌طور مستقل فرضیه آربر را تأیید کرد، بلکه کشف اولیه آربر را نیز توضیح داد. او با موفقیت یک آنزیم محدودکننده را از یک باکتری دیگر به نام هموفیلوس آنفولانزا (H.influenzae) خالص کرد و به‌طور قطع نشان داد که این آنزیم DNA را در مرکز یک توالی شش‌جفت‌باز خاص برش می‌دهد. یک سال بعد در آزمایش‌هایی که «دن ناتانز» و «کاتلین دانا» انجام دادند، از آنزیم محدودکننده اسمیت برای برش ژنوم نوعی ویروس که سلول‌های میمون و انسان را آلوده می‌کند، استفاده کردند و یازده‌قطعه DNA با اندازه‌های متفاوت را شناسایی کردند. برای این مجموعه اکتشافات پیشگامانه، آربر، اسمیت و ناتان به‌طور مشترک جایزه نوبل فیزیولوژی یا پزشکی را در سال 1978 دریافت کردند.

انواع آنزیم‌های محدود‌کننده

4 نوع اصلی آنزیم محدودکننده داریم که به شرح زیر است:

• آنزیم‌های نوع I

آنزیم‌های پیچیده، چند زیرواحدی و ترکیبی محدودکننده و اصلاح‌کننده هستند که DNA را به‌طور تصادفی و دور از توالی‌های تشخیصشان برش می‌دهند. آنزیم‌های نوع I از اهمیت بیوشیمیایی قابل‌توجهی برخوردارند، اما ارزش عملی کمی دارند زیرا قطعات محدودکننده مجزا برای جداسازی و تجزیه، تولید نمی‌کنند.

• آنزیم‌های نوع II

آنزیم‌های نوع II دارای انواع مختلفی‌اند که DNA را در موقعیت‌های تعریف‌شده نزدیک یا درون توالی‌های تشخیص خود برش می‌دهند.

• آنزیم‌های نوع III

آنزیم‌های نوع III نیز آنزیم‌های محدود‌کننده و اصلاح‌‌کننده ترکیبی بزرگی هستند. آن‌ها خارج از توالی‌های تشخیص خود می‌شکافند و برای انجام برش به دو توالی در جهت‌های مخالف در یک مولکول DNA نیاز دارند.

• آنزیم‌های نوع IV

این نوع از آنزیم‌های محدود‌کننده معمولاً یک توالی DNA اصلاح شده را تشخیص می‌دهند.

آنزیم‌های محدود‌کننده نوع II، که در توالی تشخیص خود برش می‌دهند، برای تحقیقات آزمایشگاهی مفیدترین هستند. دانشمندان از آن‌ها برای برش مولکول‌های DNA در مکان‌های خاص و جالب استفاده می‌کنند و سپس با استفاده از آنزیمی به نام DNA لیگاز، توالی‌های DNA مختلف را دوباره به یکدیگر متصل می‌کنند و توالی‌های DNA جدید و نوترکیب یا اساساً مولکول‌های DNA جدید را ایجاد می‌کنند. این رویکرد قدرتمند برای برش و چسباندن مولکول‌های DNA به‌عنوان شبیه‌سازی DNA یا فناوری DNA نوترکیب شناخته می‌شود.

نحوه استفاده از آنزیم‌های محدود‌کننده و DNA لیگاز برای واردکردن یک ژن خارجی در پلاسمید

1. پلاسمید به‌عنوان ناقلی که ژن خارجی در آن قرار می‌گیرد استفاده می‌شود.
2. هر دو انتهای ژن بیگانه با استفاده از یک اندونوکلئاز محدودکننده خاص بریده می‌شوند. برای بریدن پلاسمید دایره‌ای شکل نیز باید از همان آنزیم استفاده شود.
3. سپس ژن بیگانه را می‌توان در پلاسمید وارد کرد که با عمل لیگاز کاتالیز می‌شود. آنزیم محدودکننده قیچی مولکولی نامیده می‌شود درحالی‌که آنزیم لیگاز مانند یک چسب عمل می‌کند.

کاربردهای آنزیم‌های محدود‌کننده چیست ؟

اندونوکلئا‌زهای محدود به‌طور گسترده در تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی برای کاربردهای زیر استفاده می‌شوند:

• مهندسی ژنتیک: محبوب‌ترین کاربرد اندونوکلئازهای محدودکننده به‌عنوان ابزاری برای مهندسی ژنتیک است. فعالیت اندونوکلئاز، دستکاری ژنوم و همچنین معرفی توالی‌های مورد نیاز در ارگانیسم میزبان را امکان‌پذیر می‌کند. این منجربه تولید محصول ژن مورد نظر توسط میزبان می‌شود. این مفهوم دارای کاربردهای گسترده‌ای در بیوتکنولوژی در تولید آنتی‌بیوتیک‌ها، آنتی‌بادی‌ها، آنزیم‌ها و چندین متابولیت ثانویه است.
• نقشه‌برداری DNA: نقشه‌برداری DNA با استفاده از آنزیم‌های محدود‌کننده روشی برای به‌دست‌آوردن اطلاعات ساختاری قطعه DNA است. در این روش DNA با یک‌سری آنزیم‌های محدود‌کننده شکسته می‌شود تا قطعات DNA با اندازه‌های مختلف تولید شود. قطعات حاصل با الکتروفورز ژل آگارز (روشی برای جداسازی ماکرومولکول‌ها) جدا می‌شوند. این می‌تواند برای تعیین ساختار یک قطعه DNA ناشناخته استفاده شود.
• توالی‌یابی ژن: یک مولکول DNA بزرگ با استفاده از آنزیم‌های محدود‌کننده هضم می‌شود و قطعات حاصل از طریق توالی‌یابی DNA برای به‌دست‌آوردن توالی نوکلئوتیدی پردازش می‌شوند.
• از دیگر کاربردهای اندونوکلئا‌های محدودکننده می‌توان به بیان ژن و مطالعات جهش و بررسی پلی‌مورفیسم‌های جمعیتی و همچنین تحقیقات پزشکی قانونی اشاره کرد.

آنزیم‌های محدود‌کننده مصنوعی

آنزیم‌های محدود‌کننده ابزارهای ضروری برای فناوری DNA نوترکیب هستند که تحقیقات بیولوژیکی مدرن را متحول کرده‌اند. با این حال، استفاده از آن‌ها محدودیت‌هایی دارد. پلتفرم مبتنی‌بر Pyrococcus furiosus Argonaute” (PfAgo)” برای تولید آنزیم‌های محدود‌کننده مصنوعی (AREs) قادر است توالی‌های DNA را تقریباً در هر مکان دلخواه تشخیص داده و شکافته و انتهای چسبنده تعریف شده با طول‌های متفاوت ایجاد کند.

 CRISPR، خانواده‌ای از توالی DNA ژنوم موجودات پروکاریوتی مانند باکتری‌ها که برای ویرایش ژن «برش و چسباندن» استفاده می‌شود و “TALEN” یا اندونوکلئازهای فعال‌کننده رونویسی، که آنزیم‌های محدودکننده اصلاح‌شده هستند، دو نمونه محبوب از ARE‌ها هستند.

جمع‌بندی

آنزیم‌های محدود‌کننده از جمله فناوری‌های جدید مورد استفاده در علم زیست‌شناسی سلولی‌ومولکولی‌اند که این آنزیم‌ها راه را برای یک ابزار تحقیقاتی قدرتمند باز کردند. محققین کاربردهای مفید و مهمی از جمله تعیین توالی ژنوم‌ها، تولید مولکول‌های زیستی، داروها‌ و … که همه ما را به‌نوعی تحت‌تأثیر قرار می‌دهند، پیدا کرده‌اند.

نویسنده: مروا مهدیزاده

منابع

genome

nature

international

sigmaaldrich

genengnews

تهیـه‌شـده در آکـــادمـی ژنـــتیـــک ایــران