کیت‌ استخراج DNA

کیت‌ استخراج DNA روشی ساده و غیررسمی برای جداسازی مؤثر DNA با وزن مولکولی بالا از بافت، خون و سلول‌های کشت‌شده ارائه می‌دهد. استخراج DNA روشی برای خالص‌سازی DNA با استفاده از روش‌های فیزیکی و یا شیمیایی از نمونه جداسازی DNA از غشای سلولی، پروتئین‌ها و سایر اجزای سلولی است. فردریش میشر در سال 1869 برای اولین‌بار جداسازی DNA را انجام داد. استفاده از تکنیک جداسازی DNA باید منجربه استخراج کارآمد با کمیت و کیفیت خوب DNA شود که خالص و فاقد آلاینده‌هایی مانند RNA و پروتئین باشد. برای استخراج DNA از روش‌های دستی و همچنین کیت‌های تجاری موجود استفاده می‌شود. استخراج DNA شامل لیزکردن سلول‌ها و حل‌شدن DNA است که با روش‌های شیمیایی یا آنزیمی برای حذف ماکرومولکول‌ها، لیپیدها، RNA  یا پروتئین‌ها دنبال می‌شود.

کیت‌های استاندارد برای جداسازی و خالص‌سازی DNA چندین مزیت متمایز نسبت‌به محلول‌های سنتی دارند. علاوه بر ارائه روشی سریع و کارآمد برای استخراج DNA خالص‌شده از انواع مختلف نمونه، معرف‌های کیت‌های استخراج DNA به‌طور ویژه برای به حداقل رساندن حضور آلاینده‌ها و کاهش تخریب اسیدنوکلئوتید در طول آماده‌سازی فرموله شده‌اند.

به‌دست‌آوردن DNA خالص، اولین گام در یک آزمایش موفق زیست‌شناسی مولکولی است. استخراج و خالص‌سازی DNA اولین گام اساسی برای اطمینان از موفقیت فرایندهای پایین دستی در زیست‌شناسی مولکولی است. کلونینگ، توالی‌یابی و تقویت کارآمد PCR همه به جداسازی DNA خالص‌شده با کیفیت بالا بستگی دارد. کیفیت و خلوص DNA می‌تواند توسط تعدادی از عوامل ازجمله اندازه نمونه، وجود آلاینده‌های در یک نمونه، تخریب اسیدنوکلئیک در طول آماده‌سازی و کارایی لیز در طول آماده‌سازی نمونه تحت‌تأثیر قرار گیرد. با حساس‌ترشدن تکنیک‌های زیست‌شناسی مولکولی بهتر است که کیت‌های DNA با کیفیت بالا را ارائه دهد.

تکنیک‌هایی مانند تعیین توالی خودکار نیازمند DNA با خلوص و حداقل سطوح آلاینده، به ویژه مواد بازدارنده است. کلید یک کیت‌ استخراج DNA مؤثر، محیط اتصال به DNA است. محیط باید به شدت DNA را در یک سطح بزرگ به هم متصل کند تا بازدهی بالایی داشته باشند. علاوه‌بر این، محیط‌های اتصال DNA باید اتصال ضعیفی به پروتئین‌ها و سایر مولکول‌ها نشان‌ دهند، به‌طوری که پروتئین‌ها، RNA و مولکول‌ها با وزن مولکولی پایین  محیط اتصال تحت شرایط بافر کم نمک قبل از شست‌وشوی DNA شسته شوند.

انواع کیت‌های استخراج DNA ژنومی

• کیت “Q-Extract DNA Extraction PCR”

یک کیت ایده‌آل برای تعیین ژنوتیپ است. این کیت استخراج سریع و کارآمد DNA و تکثیر طیف وسیعی از بافت‌های پستانداران، برگ‌های گیاه، پر پرندگان، باله ماهی و بزاق را ارائه می‌دهد. استخراج DNA از بافت‌های مختلف پستانداران و برگ‌های گیاه تنها در 8دقیقه با تکثیر PCR توسط “Taq DNA Polymerase 2x Master Mix RED” انجام می‌شود.

از دیگر مزایای این روش می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• حداقل هندلینگ؛
• PCR آماده DNA؛
• نتایج PCR قابل‌اعتماد؛
• بارگزاری مستقیم ژل؛
• تنظیم مقیاس‌پذیر؛
• اتوماسیون پسند.

• کیت “SmartExtract DNA Extraction”

یک کیت استخراج ژنومی است. این کیت، استخراج DNA ژنومی را تقریبا از هر نوع نمونه خام مانند خون، بافت‌های انسانی و حیوانی، دانه‌ها و برگ‌های گیاهی به‌دست می‌آورند. در این کیت، استخراج DNA دریک لوله و تنها در 12دقیقه امکان‌پذیر است.

فواید استفاده از این کیت به شرح زیر است:

• استفاده آسان زیرا استخراج تنها در یک لوله صورت می‌پذیرد؛
• سریع است زیرا استخراج فقط در 12دقیقه تکمیل می‌شود؛
• کارآمد است زیرا بازده بازیابی بالایی دارد؛
• یک کیت واحد برای انواع نمونه‌های مختلف است؛
• به مدت 24ماه مقاوم و پایدار است.

پروتکل دقیق مورد استفاده با کیت‌ استخراج DNA برای DNA ژنومی به منبع بستگی دارد. هر کیت‌ استخراج DNA معمولا پروتکل‌های لیز سلولی و شست‌وشوی جایگزین را ارائه می‌کند که برای انواع سلول‌ها و بافت‌های رایج بهینه شده‌اند.

• کیت استخراج میتوکندری

علاوه‌بر DNA ژنومی، DNA میتوکندری (mtDNA) اغلب برای آزمایش‌های پزشکی قانونی تجزیه‌وتحلیل می‌شود. بنابراین کیت‌های استخراج DNA که برای استفاده پزشکی قانونی طراحی‌شده، برای افزایش بازده “mtDNA” دایره‌ای بهینه شده‌است. این نوع از کیت استخراج DNA چندین مزیت برای پزشکی قانونی دارد. اکثر سلول‌ها صدها نسخه از ژنوم میتوکندری و فقط دو نسخه هسته‌ای از DNA دارند. این بدان معنا است که در نمونه‌های بسیار کوچک یا نمونه‌هایی که دچار تخریب شده‌اند، احتمال بیشتری برای دریافت داده‌های مفید از نظر قانونی وجود دارد.

کیت‌ استخراج DNA برای پلاسمیدها

مقیاس کیت‎‌ استخراج DNA پلاسمید مورد استفاده به مقدار ماده اولیه و بازده DNA پلاسمید مورد نیاز بستگی دارد.

• برخلاف کیت استخراج DNA ژنومی که در آن تمام DNA استخراج می‌شود، جداسازی DNA پلاسمید شامل جداسازی DNA پلاسمید دایره‌ای از DNA ژنومی باکتری است. روش‌های مختلفی برای جداسازی DNA پلاسمید وجود دارد. یک کیت‌ استخراج DNA معمولی از نوعی لیز قلیایی و به دنبال آن انکوباسیون با ماتریس اتصال DNA و شست‌و‌شو استفاده می‌کند.

کیت‌ استخراج DNA بهینه‌شده برای پلاسمیدها با استفاده از روش لیز قلیایی اصلاح‌شده دارای چندین مزیت است که به شرح زیر است:

• خالص‌سازی سریع DNA با کیفیت بالا؛
• DNA آماده برای توالی‌یابی؛
• آلاینده‌هایی مانند DNA باکتریایی و پروتئین‌ها حذف می‌شود؛
• تصفیه مؤثر از محیط‌های پر از پروتئین مانند (TB)؛
• پروتکل مقرون به صرفه؛
• عاری از مواد شیمیایی خطرناک مانند فنل یا کلروفرم؛
• بدون نیاز به بارش اتانول؛
• بدون نیاز به اولترا سانتریفیوژ و استفاده از یک سانتریفیوژ رومیزی.

• کیت “midi” از انواع دیگر کیت‌ استخراج DNA پلاسمید است که برای تولید DNA پلاسمید کافی برای دستکاری‌های متعدد یا کاربردهای با حجم بالا مانند ساترن‌بلات یا الکتروفورز ژل میدان پالسی استفاده می‌شود.

همچنین بخوانید: پلاسمید و کاربردهای درمانی آن

سه‌مرحله‌ی اساسی برای هر استخراج DNA

برای هر روش استخراج، سه‌مرحله اساسی برای استخراج DNA وجود دارد که عبارت‌اند از: لیز، رسوب و خالص‌سازی.

• لیز: برای آزادشدن DNA ابتدا هسته و سلول شکسته می‌شوند. این کار با برش بافت به قطعات کوچک انجام می‌شود. علاوه بر این، می‌توان از مخلوط‌کن کوچک، هاون و هموژنایزر بافت نیز استفاده کرد. برای دیواره‌های سلولی نرم‌، از مواد شوینده و آنزیم‌هایی مانند پروتئیناز K برای آزادسازی پروتئین‌های سلولی و DNA استفاده می‌شود.
• رسوب: پس از لیز، DNA از هسته آزادشده اما با بخش‌های سلولی مخلوط شده‌است. این مرحله، به جداسازی DNA از بقایای سلولی کمک می‌کند. بارهای منفی موجود روی مولکول‌های DNA توسط یون‌های سدیم خنثی می‌شوند که باعث حل‌شدن بیشتر مولکول‌ها می‌شود. در این بین حلالیت آن‌ها در آب کاهش می‌یابد. سپس الکلی مانند ایزوپروپانول یا اتانول اضافه‌شده و باعث می‌شود که DNA از محلول آبی به عنوان نامحلول در الکل رسوب کند.
• خالص‌سازی: اکنون DNA از فاز آبی جدا شده‌است. برای از بین‌بردن مواد زائد سلولی و باقی‌مانده مواد ناخواسته، با الکل شسته می‌شود. DNA خالص شده مجددا در آب حل می‌شود تا به‌راحتی ذخیره شود و جابه‌جا شود.

جمع‌بندی

استخراج DNA ژنومی یکی از رایج‌ترین روش‌هایی است که در علوم زیستی انجام می‌شود. DNA ژنومی حاوی تمام مواد ژنتیکی و کروموزومی یک موجود است و تمام اجزای لازم برای زندگی را رمزگذاری می‌کند. هدف از استخراج DNA ژنومی، جداسازی این ماده ژنتیکی از بقیه سلول‌ها (پروتئین‌ها، RNA، غشای سلولی و …) است.  پس از خالص‌سازی، دانشمندان می‌توانند ژن‌های فردی را مطالعه کنند، کل ژنوم را توالی‌یابی کنند، بخش‌هایی از DNA را اصلاح کنند و موارد دیگر. استخراج DNA برای بیوتکنولوژی بسیار مهم است. این نقطه شروع برای کاربردهای متعدد، از تحقیقات بنیادی گرفته تا تصمیم‌گیری‌های تشخیصی و درمانی معمول است. استخراج و خالص‌سازی همچنین برای تعیین ویژگی‌های منحصر‌به‌فرد DNA از جمله اندازه، شکل و عملکرد آن ضروری است.

نویسندگان: یاسمن اسمی، کوثر حاجی‌پور

منابع:

1. https://www.genomics-online.com/resources/16/5006/dna-extraction-kits/
2. https://www.bio-red.com/featured/en/dna-extraction-kit.html
3. https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/genotyping/q-extract-dna-extraction-pcr-kit/
4. https://www.eurogentec.com/en/catalog/smartextract-dna-kit-dna-extraction-kit-100-preps~6a5c1eb5-f860-4e13-bd4e-202a4b61c302
5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6425773/
6. https://www.zymoresearch.com/blogs/blog/purpose-of-gdna-extraction-tips-for-success
7. https://whatisbiotechnology.org/index.php/science/summary/extraction/dna-extr:action-isolates-dna-from-biological-material
8. https://www.smacgigworld.com/blog/methods-and-steps-in-dna-extraction.php

تهیـه‌شـده در آکـــادمـی ژنـــتیـــک ایــران