تکنیک هیبریدیزاسیون درجا فلوئورسنت (FISH)

هیبریدیزاسیون درجا فلوئورسنت یا Fluorescence In Situ Hybridization) FISH)، یک تکنیک تشخیص ماکرومولکول است که به عنوان یک ظهور جدید در زمینه سیتولوژی محسوب می‌شود. در ابتدا، به عنوان یک ابزار نقشه‌برداری فیزیکی برای تعیین ژن‌های درون کروموزوم‌ها توسعه یافت.

دقت و تطبیق‌پذیری FISH متعاقبا در تحقیقات بیولوژیکی و پزشکی مورد استفاده قرار گرفت. FISH از یک پروب DNA هیبریدکننده تشکیل شده‌است که می‌تواند به طور مستقیم یا غیرمستقیم برچسب‌گذاری شود. در مورد برچسب‌گذاری مستقیم، از نوکلئوتیدهای فلورسنت استفاده می‌شود، در حالی که برچسب‌گذاری غیرمستقیم با مولکول‌های گزارشگر ترکیب می‌شود که متعاقبا توسط آنتی‌بادی‌های فلورسنت یا سایر مولکول‌ها شناسایی می‌شوند.

تاریخچه و معرفی تکنیک FISH

هیبریداسیون درجا فلورسانس تکنیکی است که برای تشخیص مکانی و کمی‌سازی اسیدهای نوکلئیک در محیط سلولی آن‌ها استفاده می‌شود. از اواخر دهه 1990 این روش به عنوان یک روش سیتوژنتیک قدرتمند برای تجزیه‌وتحلیل سلول‌ها و بافت‌ها در سطح رونوشت و ژنوم ظاهر شده‌است. در تشخیص، FISH به عنوان روش سیتوژنتیک استاندارد طلایی برای تشخیص سلول‌های بیمار یا بدخیم حاوی بازآرایی‌های کروموزومی یا انحرافات ژنی در نظر گرفته می‌شود. از زمان توسعه خود در دهه 1960 به بعد، FISH تا حد زیادی از بهبود تکنیک‌های برچسب‌گذاری پروب و استراتژی‌های خاص طراحی کاوشگر که حساسیت آن را افزایش می‌دهد، سود برد. کاربرد گسترده آن در تحقیقات و تشخیص نشان می‌دهد که تعداد انتشارات گزارش FISH از اوایل دهه 1990 به شدت افزایش یافته است. در همان زمان، تکنیک‌های “microfluidic” برای اولین‌بار ذکر شد. درک بهتر مکانیک سیالات در مقیاس طول میکرومتری منجر به همگرایی microfluidic و سنجش‌های بیوشیمیایی شده و کوچک‌سازی آن‌ها را ممکن می‌سازد. اولین گزارش‌های ترکیبی از روش‌های FISH و microfluidic به موازات افزایش زیادی در تعداد کاربردهای microfluidic از سال 2003 به بعد ظاهر شد. در سال‌های اخیر، ترکیب تکنیک‌های microfluidic و FISH محدودیت‌های مصرف پروب و زمان‌های هیبریداسیون را برطرف می‌کند و باعث می‌شود که روش آزمایشی پایدارتر و سازگارتر با پیشرفت‌های با توان بالا باشد.

معرفی تکنیک FISH و کاربرد

DNA در سلول‌های ما شامل یک مارپیچ دوتایی یا دو رشته DNA است که به طور مکرر به دور یکدیگر پیچیده می‌شوند. هر رشته شامل یک دنباله از چهار باز است: آدنین (A)، گوانین (G)، سیتوزین (C) و تیمین (T). هر پایه در یک رشته با استفاده از پیوند هیدروژنی با پایه مکمل خود در رشته دیگر جفت می‌شود (A با T، C با G). میل ترکیبی بالایی که جفت‌های باز مکمل (A-T)، (C-G) به شریک مربوطه خود متصل می‌شوند، هیبریداسیون نامیده می‌شود. درFISH، رشته‌های DNA کوچکی که با یک کاوشگر فلورسنت برچسب‌گذاری شده‌اند، اجازه دارند به قطعات DNA یک فرد، مربوط به یک منطقه ژنومی خاص، متصل شوند. این برای ارزیابی تعداد کروموزوم یا کپی ژن مفید است. اگر تکراری وجود داشته باشد، مقدار بیشتری از پروب با DNA نمونه هیبرید می‌شود و فلورسانس بیشتری تشخیص داده می‌شود. اگر حذفی در ژنوم وجود داشته باشد، کاوشگر نمی‌تواند به ناحیه مکمل خود بچسبد زیرا وجود ندارد و فلورسانس تشخیص داده نخواهد شد. این تکنیک برای خدمت به اهداف تشخیصی در پزشکی بالینی استفاده شده است.

تکنیک فیش کاربرهای مختلفی دارد که عبارت‌اند از:

• تشخیص قبل از تولد ناهنجاری‌های کروموزومی

تشخیص قبل از تولد برای تعیین سلامتی و ناهنجاری‌های مادرزادی در جنین متولدنشده حیاتی است. ناهنجاری‌های شایع کروموزومی شامل سندروم پاتو (وجود یک نسخه اضافی از کروموزوم 13)، سندرم ادوارد (وجود یک نسخه اضافی از کروموزوم 18) و سندرم داون (وجود یک نسخه اضافی از کروموزوم 21) است. هنگامی که یک پروب DNA فلورسنت در برابر مناطق سالم کروموزوم‌های 13، 18 یا 21 آزمایش می‌شود، دو سیگنال فلورسنت مربوط به دو کروموزوم مشاهده می‌شود. با این حال، در صورت تکرار ژن یا وجود یک نسخه اضافی از یک کروموزوم، سه سیگنال فلورسنت قابل مشاهده است. بنابراین، FISH منجر به تشخیص آسان اختلالات مادرزادی شده‌است که ممکن است به راحتی در زیر میکروسکوپ قابل مشاهده نباشد.

• تشخیص انواع تعداد کپی (CNVs) در بزرگسالان

انواع مختلف پروب‌های FISH می‌توانند انحرافات کروموزومی مختلف را تشخیص دهند. کاوشگرهای مخصوص یک مکان ژنی خاص می‌توانند ادغام ژن، آنیوپلوئیدی یا تعداد غیرعادی کروموزوم‌ها و از دست دادن ناحیه کروموزومی یا کل کروموزوم را در بزرگسالان تعیین کنند. FISH دارای وضوح 50 برابر بیشتر از رنگ مرسوم Giemsa برای تشخیص بیماری‌های ژنتیکی است. لکه گیمسا الگوهای روشن و تاریک یوکروماتین و هتروکروماتین را بین شاهد و مورد آزمایش مقایسه می‌کند تا عیوب را تشخیص دهد. در حالی که FISH براساس تجسم مستقیم مناطق خاصی از ژنوم است. همچنین زمان کمتری نسبت به کاریوتایپینگ دارد که نیاز به کشت سلول‌ها و متعاقبا توقف در متافاز برای مشاهده ویژگی‌های ساختاری کروموزوم‌ها دارد.

• تشخیص سرطان:

FISH به طور گسترده برای تشخیص ناهنجاری‌های کروموزومی مرتبط با سرطان استفاده می‌شود. سرطان سینه HER2 مثبت دارای نسخه‌های اضافی از ژن HER2 است و آزمایش FISH بر روی بافت سرطان سینه برداشته شده در طول بیوپسی انجام می‌شود تا نسخه‌های اضافی ژن شناسایی شود. نسخه‌های اضافی از ژن HER2 منجر به دریافت گیرنده‌های HER2 بیشتر در سلول‌ها می‌شود و این گیرنده‌ها سیگنال‌هایی دریافت می‌کنند که رشد سلول‌های سرطان سینه را تحریک می‌کنند. FISH همچنین حساسیت بالاتری در تشخیص سرطان دارد.

• تشخیص بیماری های عفونی:

RNA ریبوزومی 16S مخصوص گروه فیلوژنتیک (rRNA) در FISH برای شناسایی عوامل عفونی استفاده می‌شود. توالی‌های الیگونوکلئوتیدی مکمل 16S rRNA (طول 17-34 نوکلئوتید) به عنوان پروب‌های FISH می‌توانند برای تجزیه‌وتحلیل جوامع میکروبی در حفره دهان و فلور دستگاه گوارش استفاده شوند. پروب‌های الیگونوکلئوتیدی خاص نیز برای شناسایی پاتوژن‌ها در عفونت‌های دستگاه تنفسی طراحی شده‌اند. به طور مشابه، FISH همچنین برای شناسایی عوامل بیماری‌زا در بافت‌ها استفاده شده‌است. پروب‌های الیگونوکلئوتیدی جنس و گونه خاص برای شناسایی میکروارگانیسم‌های بیماری زا در کشت خون استفاده شده‌است. به عنوان مثال، پروب‌های FISH مکمل یک توالی خاص از 16S rRNA می‌توانند عفونت مالاریا را در نمونه‌های خون تشخیص دهند.

انواع پروب در تکنیک FISH

3نوع اصلی پروب در FISH استفاده می‌شود که هرکدام کاربرد متفاوتی دارند:

• کاوشگرهای اختصاصی مکان: این نوع کاوشگر به ناحیه خاصی از کروموزوم متصل می‌شود. این کاوشگرها در تشخیص سندروم‌های ریزحذف و ریزدوپلیکاسیون در یک کروموزوم خاص مفید هستند.
• پروب‌های تکراری: آن‌ها از توالی‌های تکراری موجود در وسط هر کروموزوم تولید می‌شوند که می‌تواند برای تعیین اینکه آیا یک فرد تعداد کروموزوم‌های صحیحی دارد یا خیر، استفاده می‌شود. هنگامی که از این کاوشگرها همراه با کاوشگرهای مخصوص مکان استفاده می‌شود، می‌توان برای تعیین اینکه آیا یک فرد ماده ژنتیکی را در یک کروموزوم خاص از دست داده‌است یا خیر، استفاده کرد.
• پروب‌های کل کروموزوم: آن‌ها مجموعه‌ای از پروب‌های کوچک هستند که با رنگ‌های فلورسنت مختلف برچسب‌گذاری شده‌اند که هر کدام به دنباله‌ای متفاوت در امتداد یک کروموزوم معین متصل می‌شوند. از این کاوشگرها می‌توان برای نقشه‌برداری کل کروموزوم استفاده کرد و اطلاعاتی از ناهنجاری‌های کروموزومی ارائه کرد.

مراحل انجام تکنیک FISH

ابتدا یک پروب که توالی آن مکمل توالی مورد نظر است ساخته می‌شود. پس از آنکه پروب ساخته شد، آن را توسط مواد فلورسنت نشاندار می‌کنند. حال نمونه‌ها را روی اسلاید ثابت کرده و دناتوره می‌کنند و رشته‌های DNA از یکدیگر جدا می‌شوند. سپس رشته‌های DNA پروب را دناتوره و جدا می‌کنند و روی اسلاید قرار می‌دهند. در این مرحله پروب به توالی مکمل خود پس از گذشت زمانی متصل می‌شود. حال پروب‌های اضافه شسته شده و نمونه توسط میکروسکوپ فلورسنت مشاهده می‌شود.

مزایا و معایب

کاوشگرهای رادیواکتیو هزینه زیادی را دربرمی‌گیرند و همچنین مواد رادیواکتیو دارای خطر بالایی هستند. همچنین برای تولید سیگنال‌های قابل اندازه گیری روی فیلم، زمان‌های طولانی مدتی برای تماس مورد نیاز است. وضوح این روش بالا نیست. مواد رادیواکتیو که برای کاوشگرها استفاده می‌شوند، پایدار است به همین دلیل ایزوتوپ‌ها به مرور از بین می‌رفتند و به همین علت فعالیت اختصاصی کاوشگرها به صورت ثابت باقی نمی‌ماند.
FISH امکان پیشرفت‌های زیاد را در زمینه وضوح سرعت و امنیت ایجاد کرده است و همچنین با این تکنیک پیشرفته‌تر می‌توان بطور همزمان شناسایی مولکول‌های هدف چندتایی، آنالیزهای کمی و تصویربرداری‌های زنده سلولی را انجام داد. اهداف جديد باعث ايجاد اين پيشرفت‌هاي بزرگ شد و همچنين باعث محبوبيت بيشتر اين ازمايش در دهه ١٩٩٠ شد.

جمع‌بندی

در مقایسه با روش های تشخیص کلینیکی معمول، FISH بسیار دقیق‌تر و مستقیم‌تر و قابل‌ اعتمادتر است. با استفاده از این روش ما می‌توانیم ژن‌ها، کروموزوم ها، رونویسی و حرکات نوکلئیک‌اسید را دیده و بررسی کنیم. درمورد استفاده از تکنولوژی FISH دریافتیم که این تکنیک به دلیل کمبود دانش و متخصص، استفاده بسیار محدودی در کشورهای درحال توسعه دارد. بنابراین، FISH باید روش ارجح در پیش‌بینی مولفه‌های پیچیده بیان ژن باشد. امروزه پیشرفت های تکنولوژیکی آنالیز کمی و وضوح چند منظوره را ممکن ساخته است که هر دو عامل تکنیک FISH را در تمامی زمینه‌های تحقیقاتی در مورد اسید های نوکلئیک، به روشی پرکاربرد تبدیل کرده و راه را برای توسعه شناسایی همزمان مولکول‌های هدف چندتایی، آنالیزهای کمی و تصویربرداری‌های زنده سلولی هموار ساخته است. در آینده، این تکنیک احتمالا تاثیر چشمگیری بر تصویربرداری از سلول‌های زنده و تشخیص‌های درمانی خواهد گذاشت.

نویسنده: یاسمن اسمی

منابع:

1. https://www.cureus.com/articles/7529-application-of-fluorescence-in-situ-hybridization-fish-technique-for-the-detection-of-genetic-aberration-in-medical-science#!/
2. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S259000721830008X
3. https://www.news-medical.net/life-sciences/Applications-of-FISH.aspx
4. https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-types-of-probes-are-used-in-fluorescence-in-situ-hybridization-FISH
5. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16450896/
6. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6157553/
7. https://civilica.com/doc/118919/