نرم‌افزارهای طراحی sgRNA

قبل از صحبت درمورد نرم‌افزارهای طراحی sgRNA خوب است بگوییم؛ جهان امروزی، در حال تجربۀ یک انقلاب بیوتکنولوژی است. پیشرفت‌ در زمینۀ ژنومیک توسط فناوری “CRISPR-Cas9” اتفاق افتاد و به‌وسیله همین فناوری رهبری می‌شود. امروزه نرم‌افزارهای قدرتمند طراحی شده برای CRISPR مانند نرم‌افزارهای طراحی sgRNA، یافتن سایت‌ها، طراحی RNAهای راهنما و تجزیه‌وتحلیل نتایج ویرایش محققان را آسان‌تر و سریع‌تر کرده‌است.

فناوری CRISPR، یک ماشین ویرایش ژنی دوگانه است که امکان اصلاح ژنتیکی توسط sgRNA، (RNAتک‌راهنما) را فراهم می‌کنند. SgRNA را می‌توان با سنتز شیمیایی، رونویسی در شرایط آزمایشگاهی و رونویسی درون سلولی ایجاد کرد. حائز اهمیت است که sgRNA را می‌توان از نظر ساختاری مهندسی کرد تا تغییرات شیمیایی، تغییرات طول فاصله، تغییرات توالی، ترکیبی از اجزای RNA یا DNA و همچنین ترکیبی از دئوکسی‌نوکلئوتیدها را پوشش دهد. sgRNA مهندسی‌شده به‌طور انتقادی ویرایش ژنوم خاص، موثر و ایمن‌تری را ارائه می‌کند و درنهایت به مزایای بالینی ژن‌درمانی می‌رسد.

 صفحه نمایش ژنتیکی مبتنی‌بر CRISPR-Cas9 یک ابزار جدید قدرتمند در زیست‌شناسی است. با تغییر دادن توالی RNA تک‌راهنما (sgRNA)، می‌توان Cas9 را برای هدف قراردادن مکان‌های مختلف در ژنوم با سهولت نسبی دوباره برنامه‌ریزی کرد، اما فعالیت روی هدف و اثرات خارج از هدف  sgRNA‌های فردی می‌تواند بسیار متفاوت باشد.

همچنین بخوانید: استفاده از کریسپر در تشخیص بیماری

اصطلاح sgRNA

sgRNA، مخفف RNA راهنمای منفرد است. همان‌طور که از نام آن پیداست، یک مولکول RNA منفرد است، که شامل دو توالی “crRNA” و “tracrRNA” است. sgRNAها، به محبوب‌ترین فرمت برای RNA‌ها راهنمای CRISPR نزد محققان تبدیل شده‌اند. برخی از محققین RNAهای راهنما را با اجزای crRNA و tracrRNA جدا استفاده می‌کنند که معمولا به‌عنوان gRNAهای دوتکه نامیده می‌شوند. اصطلاح sgRNA قبلا برای اشاره به انواع مختلف RNAهای CRISPER ازجمله RNAهای راهنمای مصنوعی و RNA راهنمای کوتاه استفاده می‌شد. در حال حاضر sgRNA به جایگاه ساده‌تری اشاره دارد که هر دو عنصر crRNA و tracrRNA را در یک مولکول RNA واحد ترکیب می‌کند.

اهمیت sgRNA

ویرایش هدفمند ژنوم در حال حاضر تقریبا در هر موجود زنده‌ای امکان‌پذیر است. در میان تکنیک‌های ویرایش ژن موجود، سیستم CRISPR-Cas9 زبانزد است. زیرا نشان داده شده که در بسیاری از گونه‌ها جواب می‌دهد و لزوما منجربه افزودن DNA خارجی در محل هدف نمی‌شود و همچنین از مجموعه‌ای از قوانین طراحی ساده پیروی می‌کند. استفاده از سیستم CRISPR-Cas9 با در دسترس‌بودن مجموعه ای از ابزارهای طراحی CRISPR تسهیل می‌شود که در مشخصات طراحی و انتخاب پارامترها، ژنوم‌های موجود و عملکرد تجزیه‌و تحلیل متفاوت است.

اگرچه CRISPR-Cas9 یک سیستم ایمنی سلولی است، تکنیک مهندسی ژنوم مرتبط با استفاده از پروتئین Cas9  و (sgRNA) اغلب به‌عنوان سیستم CRISPR Cas9  شناخته می‌شود. اصطلاح CRISPR در واقع مربوط به “CRISPR arrays” است و نه تکنیکی که برای مهندسی ژنوم استفاده می‌شود. طراحی (sgRNA) یک مشکل مهم به منظور قابل‌اعتمادکردن سیستم های CRISPR/Cas9 است. فرایند طراحی sgRNAها شامل شناسایی توالی‌های 20نوکلئوتیدی در مجاورت یک موتیف مجاور “protospacer” است که به‌طور بالقوه می‌تواند به‌عنوان sgRNA عمل کند. سپس الگوریتم یادگیری با اینsgRNA های بالقوه به‌عنوان ورودی استفاده می‌شود تا آن‌ها را به 2 گروه sgRNAهای عملکردی و غیرعملکردی براساس ویژگی‌هایی که برای آموزش الگوریتم یادگیری استفاده شده‌است، طبقه‌بندی کند.

تکرارهای کوتاه پالیندرومیک خوشه‌ای با فاصله منظم (CRISPR) ویرایش ژن با واسطه Cas9 ابزاری قدرتمند با پتانسیل بسیار زیاد در توسعه استراتژ‌ی‌های درمانی جدید برای طیف وسیعی از بیماری‌ها است. کارایی ویرایش ژن با استفاده از اندونوکلئاز Cas9 به توالی (sgRNA) بستگی دارد. sgRNA یک کمپلکس مصنوعی از crRNA و tracrRNA است که برای شکست دورشته‌ای CRISPR/Cas9  جایگاه اختصاصی ضروری است. یکی از بزرگ‌ترین چالش‌ها با استفاده از فناوری CRISPR/Cas9، به حداقل رساندن فعالیت خارج از هدف، به‌ویژه در مکان‌هایی با همسانی توالی با منطقه موردنظر بوده است. توالی crRNA قادر به تحمل عدم‌تطابق با DNA هدف است که منجربه فعالیت خارج از هدف می‌شود.

ویژگی‌های ذاتی که باید هنگام طراحی sgRNA در نظر گرفته شوند عبارت‌اند از: تعداد و توزیع مکان‌های جفت عدم تطابق خارج از هدف، تمایل به تشکیل ساختارهای ثانویه، نوکلئوتیدها در موقعیت‌های خاص، محتوای GC و ویژگی‌های مکان‌های هدف بالقوه و خارج از هدف. بنابراین بهینه‌سازی طراحی sgRNA که واسطه هدایت Cas9 به محل هدف است، برای فعالیت کارآمد CRISPR/Cas9 بسیار مهم است.

بررسی نرم‌افزارهای طراحی sgRNA و عملکرد آن‌ها

برخی از مدل‌های طبقه‌‌بندی مورد استفاده در نشریات و ابزارهای مختلف تحقیقاتی عبارت‌اند از:

• “WU-CRISPR”: این ابزار دانشگاه واشنگتن از یک (support vector machine” (SVM” با هسته تابع پایه شعاعی (RBF) برای تمایز بین sgRNAهای عملکردی و غیرکاربردی استفاده کرد. هسته “RBF” در طبقه‌بندی داده‌هایی که به صورت خطی قابل تفکیک نیستند کاربرد دارد.
• پلتفرم اختلال ژنتیکی (GPP): گروه GPP دو ابزار برای طراحی sgRNA ایجاد کرده‌است. ابزار اول از مدل یادگیری ماشینی برای طراحی sgRNA استفاده نکرد. تحقیق برای ابزار دوم که در سال 2016 توسعه یافت، از چندین مدل در تلاش برای شناسایی مدلی استفاده کرد که بهترین عملکرد را داشت. مدل‌های طبقه‌بندی پیش‌بینی مورد استفاده در این ابزار عبارت‌اند از:
• رگرسیون خطی
• L1 رگرسیون خطی منظم
• L2 رگرسیون خطی منظم
• ماشین بردار پشتیبانی به اضافه رگرسیون لجستیک
• طبقه‌بندی الگوریتم جنگل تصادفی
• الگوریتم تقویت گرادیان
• رگرسیون لجستیکL1
• دسته‌بندی ماشین بردار پشتیبان
• “DeepCRISPR :”DeepCRISPR یکی از اولین ابزارهای طراحی sgRNA است که از شبکه‌های عصبی عمیق برای این منظور استفاده می‌کند. به‌طور خاص، از یک شبکه عصبی انحرافی عمیق برای پیاده‌سازی الگوریتم یادگیری بازنمایی بدون نظارت عمیق استفاده می‌کند.

• مطالعه روی ویژگی‌های توالی کلیدی sgRNAها: این مطالعه، که فقط ویژگی‌های متوالی sgRNAها را در نظر می‌گیرد، از یک ماشین بردار پشتیبان برای پیاده‌سازی یک مدل طبقه‌بندی برای sgRNA‌های عملکردی و غیرعملکردی استفاده می‌کند.
• “Library-on-library approach”: این مطالعه همچنین یک ماشین بردار پشتیبان را برای گرفتن رابطه بینsgRNA های عملکردی و غیرعملکردی اجرا کرد. برای ارزیابی دقت مدل از اعتبارسنجی متقابل ده‌برابری و داده‌های آزمون استفاده شد.

طراحی sgRNA با استفاده از نرم‌افزارهای مختلف

نرم‌افزارهای مختلفی برای طراحی sgRNA وجود دارد که بهترین آن‌ها شامل موارد زیر می‌شود:

• سایت مربوط به آزمایشگاه ژانگ، در گذشته یکی‌از قوی‌ترین منابع طراحی بود که در حال حاضر کار نرم‌افزاری انجام نمی‌دهد.
• نرم‌افزار “Benchling”، قوی‌ترین نرم‌افزار بحث کریسپر و مهندسی ژنتیک است که متأسفانه در حال حاضر امکان دسترسی به آن وجود ندارد یا به سختی ممکن است.
• از دیگر نرم‌افزارها می‌توان به CRISPOR اشاره کرد، که کار با آن شامل سه‌مرحله است.
• سایت “deskgen”، خدمات مختلف طراحی sgRNAرا براساس هدف محققین ارائه می‌دهد.
• سایت “guides.sanjanalab.org”، از مزیت‌های این سایت طراحی guideRNA، تولید کتابخانه کریسپر و طراحی sgRNA های متفاوت برای یک ژن است.
• سایت “Off-Spotter”، در این سایت sgRNA طراحی نمی‌شوند و در واقع نوعی کنترل کیفی محسوب می‌شود.
• سایت “E-CRISP”، از مزیت‌های این سایت توانایی همزمان طراحی sgRNA و Off-targetها است؛ یعنی هم قابلیت Design و هم قابلیت Evaluation دارد.
• سایت CRISPR-ERA، در این سایت می‌توان طراحی sgRNA را با کیفیت بالا مشاهده کرد. ابتدا باید اطلاعاتی از قبیل گونه، ژن و ناحیۀ ژن روی کروموزوم را مشخص و همچنین فعالیت نوکلئازی یا کینازی ویرایش ژنوم را تعیین کرد. بعد از شروع، sgRNA طراحی شده را همراه با منطقه، ناحیه کروموزومی، رشتۀ مثبت و منفی و یکسری اطلاعات مربوط به کنترل کیفی را به ما می‌دهد.
• سایت “CHOPCHOP”، این سایت گونه‌های زیادی را پوشش می‌دهد؛ این سایت همچون CRISPR-ERA، تعیین نواحی موردنظر، تعیین درصد بازها، ایزوفرم، مشخصات Cas و Off-trageها و حتی پرایمر را به ما می‌دهد.

جمع‌بندی

توالی RNA راهنمای CRISPR مستقیما بر کارایی برش DNA هدف و برش غیرعمدی خارج از هدف تأثیر می‌گذارد. بنابراین، طراحی RNA راهنمای مناسب یک گام حیاتی برای موفقیت آزمایش‌های CRISPR است و چندین پارامتر مهم وجود دارد که باید در هنگام طراحی یک RNA راهنما در نظر گرفت.

نویسندگان: کوثر حاجی‌پور، یاسمن اسمی

منابع

scholarworks

ncbi.nlm

nature

ncbi.nlm

synthego

برداشتی از جزوۀ جلسه 15 دوره ژن‌درمانی

تهیـه‌شـده در آکـــادمـی ژنـــتیـــک ایــران