فهرست مطالب
حتما تاکنون نام تکنیک رنگ‌آمیزی باکتری‌ها را شنیده‌اید؛ جالب است بدانید که رنگ‌آمیزی یکی از تکنیک‌های متداول در آزمایشگاه است که با ایجاد کنتراست (تضاد) در نمونه زیر میکروسکوپ، به شناسایی و شناخت اجزای نمونه میکروسکوپی مورد نظر کمک میکند؛ به‌عنوان مثال برای تشخیص اندامک‌های سلولی یا بررسی ساختار یک بافت مانند رشته‌های عضلانی از این تکنیک استفاده می‌شود.
از رنگ‌آمیزی تنها در آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی استفاده نمی‌شود بلکه می‌توان از آن برای بررسی ساختار مواد، مانند ساختار لایه‌ای پلیمرهای نیمه کریستالی نیز استفاده کرد.
تاریخچه رنگ‌آمیزی باکتری‌ها
هانس کریستین گرم، پاتولوژیست، زیست‌شناس و میکروبیولوژیست دانمارکی که بر روی بیماری ذات‌الریه و عوامل ایجاد آن، یعنی کلبسیلا پنومونیا (Klebsiella pneumoniae) و استرپتوکوکوس پنومونیا (Streptococcus pneumoniae) کار می‌کرد، هنگام کار بر روی بافت‌های ریوی اجساد آلوده به ذات‌الریه کشف کرد که برخی از رنگ‌های توسط سلول‌های باکتریایی به صورت انتخابی جذب می‌شوند.
بر همین اساس او از یک‌سری معرف‌ها به منظور ایجاد واکنش‌های شیمیایی خاص استفاده کرد. او این معرف‌ها را بر روی نمونه‌های بافت ریه چکاند و تفاوت‌هایی را در رنگ‌پذیری باکتری‌های مولد ذات‌الریه که امروزه آن‌ها را تحت عنوان کلبسیلا پنومونیا و استرپتوکوکوس پنومونیا می‌شناسیم، مشاهده کرد. تفاوت‌هایی که گرم مشاهده کرده بود، مربوط به آرایش ساختمانی دیواره‌ی سلولی در باکتری‌ها بود.
گرم در این روش، ابتدا یک اسمیر مایع بر روی یک لام شیشه‌ای تهیه کرد و آن را با استفاده از شعله خشک کرد؛ سپس محلولی از کریستال ویوله را بر روی آن ریخت و پس از شست‌وشو با آب، محلول لوگول یا همان پتاسیم تری یدید را اضافه کرد که باعث تثبیت رنگ می‌شود.
وی در مرحله‌ی بعد برای شستن رنگ از اتانول استفاده کرد و مشاهده کرد که باکتری‌هایی خاص یا همان پنوموکوکسی‌ها، رنگ را جذب می‌کنند که در اصطلاح به آن‌ها گرم مثبت اطلاق می‌شود. با به‌کارگیری این روش، حدود ۳۰ هزار گونه‌ی باکتریایی شناخته شده مورد بررسی قرار گرفت و در دو گروه گرم مثبت و گرم منفی طبقه بندی شدند.
نوآوری گرم در ارائه‌ی این تکنیک غیرقابل انکار است، با این‌حال کاستی‌هایی نیز در آن وجود داشت از جمله اینکه گرم، در روش رنگ‌آمیزی خود از رنگ قرمز متضاد استفاده نکرده بود و به همین علت باکتری‌های گرم منفی که پس از رنگ‌آمیزی به رنگ صورتی درمی‌آیند، زیر میکروسکوپ آشکار نشدند. در واقع چند سال بعد، یک پاتولوژیست آلمانی به نام کارل ویگرت، یک مرحله‌ی دیگر به این روش رنگ‌آمیزی اضافه کرد. ویگرت در این مرحله از رنگ‌آمیزی در باکتری‌ها، رنگ سافرانین را به‌کار برد.
هرچند در روش پیشنهادی گرم نقص‌هایی وجود داشت، بااین‌حال می‌توان ادعا کرد که وی موفق به ارائه‌ی تکنیکی برای رنگ‌آمیزی باکتری‌ها و بررسی آن‌ها شد که همچنان پس از گذشت صد سال، از متداول‌ترین و کاربردی‌ترین روش‌ها برای مطالعه‌ی باکتری‌ها و تمایز بین دو گروه اصلی از باکتری‌ها و نیز طبقه‌بندی آن‌هاست که از مهم‌ترین کارها در میکروبیولوژی پزشکی به‌شمار می‌رود.
همچنین بخوانید: آشنایی با انواع محیط کشت‌های میکروبی
انواع روش‌های رنگ‌آمیزی باکتری‌ها
- رنگ‌آمیزی ساده (Simple Stains)
- رنگ‌آمیزی گرم (Gram Stain)
- رنگ‌آمیزی اسید فست (Acid-Fast Stain)
- رنگ‌آمیزی اندوسپور (Endospore Stain)
- رنگ‌آمیزی کپسول (Capsule Stain (Negative staining
1_ رنگ‌آمیزی ساده (Simple Stains):
رنگ آميزي ساده يك تكنيك ساده، سريع و غير اختصاصي برای رنگ‌آمیزی باکتری‌ها است که معمولا برای تشخیص شکل، اندازه و ترتيب قرار گرفتن باکتری‌ها کنار هم، بکار می‌رود. در اين نوع رنگ‌آميزي، همه سلول‌ها به يك شكل رنگ مي‌گيرند. در رنگ آمیزی ساده ترجیحا از رنگ‌های بازی (کروموژن با بار مثبت) استفاده می‌شود؛ زیرا اسیدهای نوکلئیک و ترکیبات خاص دیواره سلولی باکتری‌ها دارای بار منفی بوده و با کروموژن‌های کاتیونیک پیوند برقرار می‌کنند. رنگ‌هایی که در این نوع رنگ‌آمیزی استفاده می‌شود شامل: متيلن بلو، كريستال ويوله، سافرانين و فوشين است که بسته به نوع رنگ‌آميزي استفاده شده، رنگ باكتري متفاوت خواهد بود.
2_ رنگ‌آمیزی گرم (Gram Stain):
یکی از مهم‌ترین ومتداول‌ترین روش‌های رنگ آمیزی باکتری‌ها در رشته میکروبیولوژی، رنگ‌آمیزی گرم است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین روش، رنگ آمیزی باکتری‌ها بر مبنای رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند .رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول و یا به عبارتی دیگر به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد.
در رنگ آمیزی گرم ابتدا رنگ کریستال ویوله به اسمیر باکتری اضافه می‌کنیم که به لایه پپتیدوگلیکان نفوذ میکند، سپس محلول ید (لوگل) به عنوان تثبیت کننده رنگ اولیه عمل کرده و یک کمپلکس نامحلول با کریستال ویوله ایجاد میکند به‌طوری که در مرحله رنگ‌بری، رنگ باکتری‌های گرم مثبت که لایه پپتیدوگلیکان ضخیمی دارند، از بین نمی‌رود در صورتی که رنگ باکتری‌های گرم منفی به‌دلیل وجود لیپید در دیواره سلولی و حل شدن آن ب‌هوسیله مواد رنگ‌بر به‌راحتی از بین می‌رود. در مرحله آخر رنگ‌آمیزی باکتری‌ها به روش گرم، فوشین یا سافرانین به‌عنوان رنگ مکمل یا متضاد افزوده می‌شود تا باکتری‌های بی‌رنگ (گرم منفی) را به رنگ قرمز رنگ‌آمیزی کند.
3_ رنگ‌آمیزی اسید فست (Acid-Fast Stain):
یکی دیگر از روش‌های رنگ‌آمیزی افتراقی مهم، رنگ‌آمیزی باکتری‌ها به روش اسید فست است. از این روش، بیشتر برای شناسایی گونه‌های مایکوباکتریوم استفاده می‌شود. این باکتری‌ها در دیواره‌ی سلولی خود دارای مقداری زیادی گلیکولیپید، مانند اسید مایکولیک است. در واقع اسید مایکولیک از اتصال آسان رنگ‌ها به سلول‌ها جلوگیری میکند.
در این روش از رنگ کربول فوشین استفاده می‌شود. این رنگ محلول در چربی است و نیز دارای فنول می‌باشد که نفوذ رنگ به داخل دیواره سلولی را تسهیل میکند.
4_ رنگ‌آمیزی اندوسپور (Endospore Stain):
برخی باکتری‌ها در شرایط محیطی سخت، قادرند ساختارهای مقاومی به نام اندوسپور را تشکیل دهند تا از باکتری‌ها در مقابل شرایط نامساعد، محافظت کند. باکتری‌ها در شرایط مساعد مجدد به فرم رویشی تبدیل می‌شوند.
در این روش ابتدا اندوسپورها با مالاشیت گرین به همراه حرارت رنگ‌آمیزی می‌شوند که این رنگ بسیار قوی است و می‌تواند به اندوسپورها نفوذ کند. پس از تیمار مالاشیت گرین، بقیه سلول که رنگ نگرفته است با آب شسته شده و با سافرانین رنگ‌آمیزی می‌شود. در آخر باکتری‌ها به رنگ قرمز و اندوسپورها به رنگ سبز در داخل سلول باکتری قابل مشاهده است.
5_ رنگ‌آمیزی کپسول یا رنگ‌آمیزی منفی (Capsule Stain):
هدف اصلی از این رنگ‌آمیزی، تشخیص کپسول در سلول باکتری است. کپسول، یک لایه بیرونی ژلاتینی است که توسط سلول باکتری ترشح می‌شود و دیواره سلولی را احاطه کرده و به آن می‌چسبد. اکثر کپسول‌ها از جنس پلی‌ساکارید هستند؛ اما برخی از آن‌ها از پلی‌پپتیدها تشکیل شده‌اند. تفاوت این کپسول با لایه چسبناکی که اغلب سلول‌های باکتریایی تولید می‌کنند این است که یک لایه ضخیم، قابل تشخیص و مجزا در خارج از دیواره سلولی است.
از رنگ‌آمیزی‌های متداول برای مشاهده کپسول باکتریایی می‌توان به روش جونز، روش رنگ‌آمیزی منفی، روش آنتونی و روش گراهام-اوانس اشاره نمود.
رنگ‌آمیزی کپسول به دلیل محلول بودن این لایه در آب، نسبتاً رنگ‌آمیزی مشکلی است؛ زیرا امکان دارد به وسیله شستشوی زیاد، کپسول باکتری از بین برود. از طرفی این لایه به حرارت نیز حساس بوده و دمای زیاد باعث تخریب آن می‌گردد؛ لذا از رنگ‌آمیزی منفی برای مشاهده آن، استفاده می‌شود.
در رنگ‌آمیزی منفی، زمینه با استفاده از رنگ‌های اسیدی رنگ می‌گیرد ولی کپسول باکتری بدون رنگ باقی می‌ماند. در این روش کپسول به‌صورت هاله‌ای شفاف در اطراف باکتری و در یک زمینه تاریک مشاهده می‌شود.
نویسندگان: زهرا سمیعی _ ستاره سنگری
درود خسته نباشید و خداقوت، مطالب بسیار جامع و کاربردی بود و سوالاتم در این زمینه را پاسخ داد⚘️🙏🏻