تکنیک فلوسایتومتری

فلوسیتومتری یک تکنیک مبتنی‌بر لیزر است که برای تجزیه‌وتحلیل خصوصیات شیمیایی و فیزیکی سلول‌ها یا ذرات استفاده می‌شود. برنامه‌های کاربردی فلوسایتومتری، تکنیک‌ها و استفاده‌های فراوانی دارد که در رشته‌های مختلف، مورد استفاده قرار می‌گیرد.

فلوسایتومتری چیست؟

فلوسایتومتری، یک آزمایش آزمایشگاهی است که برای تجزیه‌وتحلیل ویژگی‌های سلول‌ها یا ذرات استفاده می‌شود. در طول فرایند، نمونه‌ای از سلول‌ها یا ذرات در مایع معلق می‌شود، تقریبا 10000 سلول را می‌توان در کمتر از یک‌دقیقه توسط رایانه تجزیه، تحلیل و پردازش کرد. تکنیک فلوسایتومتری طی سی‌سال گذشته شاهد پیشرفت‌های چشمگیری بوده‌‌است که امکان جزئیات بی‌سابقه‌ای را در مطالعات سیستم ایمنی و سایر زمینه‌های زیست‌شناسی سلولی فراهم کرده‌‌است. این ابزار قدرتمند در رشته‌های مختلفی مانند ایمونولوژی، زیست‌شناسی مولکولی، باکتری‌شناسی، ویروس‌شناسی، بیولوژی سرطان و پایش‌ بیماری‌های عفونی استفاده می‌شود. به‌عنوان مثال برای مطالعه سیستم ایمنی و پاسخ آن به بیماری‌های عفونی و سرطان بسیار موثر است.

کاربرد فلوسایتومتری

تکنیک فلوسایتومتری این امکان را برای شناسایی همزمان جمعیت‌های ترکیبی سلول‌ها از خون و مغز استخوان و همچنین بافت‌های جامد که می‌توانند به سلول‌های منفرد مانند غدد لنفاوی، طحال، بافت‌های مخاطی، تومورهای جامد و … تفکیک شوند، می‌دهد. علاوه بر آنالیز جمعیت‌های سلولی، یک کاربرد اصلی فیلوسایتومتری، مرتب‌سازی سلول‌ها برای تجزیه‌وتحلیل بیشتر است. به‌طور خاص، فلوسایتومتری در تحقیقات برای اهداف مختلفی استفاده می‌شود که می‌توان موارد زیر را نام برد:

• شمارش سلول؛
• مرتب‌سازی سلولی؛
• تعیین عملکرد سلول؛
• تعیین خصوصیات سلولی؛
• شناسایی میکروارگانیسم‌ها مانند قارچ، باکتری یا مخمر؛
• یافتن نشانگرهای زیستی (خصوصیاتی که عملکرد طبیعی را نشان می‌دهد)؛
• تشخیص و درمان بالقوه سرطان خون و مغز استخوان؛
• توصیف و شمارش انواع گلبول‌های سفید خون در ارزیابی بیماری‌های عفونی؛
• اختلالات خود ایمنی یا نقص ایمنی؛
• تشخیص و طبقه‌بندی لوسمی یا لنفوم.

همچنین از تکنیک فلوسایتومتری معمولا برای آزمایش پیگیری پس از شمارش کامل خون (CBC) یا اسکن سلول‌‌‌‌‌‌های سفید خون (WBC) استفاده می‌شود.

فلوسیتومتری چگونه کار می‌کند؟

نمونه خون، مغز استخوان یا سلول‌های بافتی در یک سوسپانسیون قرار می‌گیرد و به دستگاه فلوسایتومتر تزریق می‌شود. سلول‌ها در یک خط فایل مرتب می‌شوند و سپس از مقابل پرتو لیزر، نور پراکنده و نور فلورسنت عبور می‌کند. سپس سلول‌ها شمارش و دسته‌بندی می‌شوند. داده‌ها در رایانه ذخیره می‌شود و از طریق هیستوگرام یا نمودار نقطه‌ای گزارش می‌شود.

فلوسیتومترها از لیزرها به‌عنوان منابع نوری برای تولید سیگنال‌های نور پراکنده و فلورسنت استفاده می‌کنند که توسط آشکارسازهایی مانند دیویدهای نوری خوانده می‌شود. این سیگنال‌ها به سیگنال‌های الکترونیکی تبدیل شده و توسط کامپیوتر آنالیز می‌شوند و در نهایت در یک فایل داده با فرمت استاندارد نوشته می‌شود. جمعیت سلولی ‌را نیز می‌توان براساس ویژگی‌های فلورسنت یا پراکندگی نور آن‌ها تجزیه‌وتحیل و یا خالص کرد. انواع معرف‌های فلورسنت که در تکنیک فلوسایتومتری استفاده می‌شود شامل آنتی‌بادی‌های کونژوگه فلورسنت، رنگ‌های شاخص یونی و پروتئین‌های بیان فلورسنت هستند.

اگر انواع مختلف سلول‌ها به‌طور همزمان مورد آزمایش قرار گیرند، مانند سلول‌های خونی و بافتی، از فلوسیترومتری چند رنگ استفاده می‌شود. انواع سلول‌های خاص با رنگ فلورسنت مسخص می‌شوند، سپس دستگاه فلوسایتومتر سلول‌ها را براساس نوع و رنگ مرتب می‌کند.

انواع فلوسایتومتری

ابزار دقیق مورد استفاده برای فلوسایتومتری طی چند دهه اخیر تکامل یافته است. سیستم‌های لیزری چندگانه و ابزارهایی که برای اهداف خاص طراحی می‌شوند، رایج هستند مانند سیستم‌های با لودر‌های 96 چاهی که برای تجزیه‌و‌تحلیل مهره‌ها طراحی شده‌اند، سیستم‌هایی که میکروسکوپ و فلوسایتومتری و سیستم‌هایی که طیف‌سنجی جرمی و فلو سایتومتری را ترکیب می‌کنند.

• فلوسایتومترهای سنتی

فلوسیتومترهای سنتی، از سه سیستم سیالیک، اپتیک و الکترونیک تشکیل شده‌اند. سیستم مایعات (معمولا یک محلول نمک بافر) است که تحت‌فشار قرار می‌گیرد تا نمونه را به نقطه رهگیری لیزری یا نقطه بازجویی که در آن نمونه تجزیه‌وتحلیل می‌شود، برساند. سیستم نوری شامل اپتیک‌های تحریک (لیزر) و اپتیک‌های جمع‌آوری (لوله‌های ضرب فتو یا PMT و فوتودیود) است که سیگنال‌های نور مرئی و فلورسنت مورد استفاده برای تجزیه‌وتحلیل نمونه را تولید می‌کند. مجموعه‌‌ای از فیلترهای دو رنگ، نور فلورسنت را به آشکارسازهای خاص هدایت می‌کنند و فیلترهای باند، طول موج‌های نور خوانده شده را تعیین می‌کنند تا هر فلوروکروم جداگانه را بتوان تشخیص داد و اندازه‌گیری کرد.

به‌طور خاص، فیلترهای دو رنگ، فیلترهایی هستند که نور را از طریق طول موج کوتاه‌تر یا طولانی‌تر عبور می‌دهند و نور باقی‌مانده را در یک زاویه منعکس می‌کنند. به عنوان مثال، یک فیلتر 450  (DLP) به نوری که طول موج 45 نانومتر دارد اجازه می‌دهد از فیلتر عبور کند و طول موج‌های کوتاه‌تر نور را با زاویه منعکس کند تا به آشکارساز دیگری ارسال شود. سیستم الکترونی سیگنال‌های آشکارساز را به سیگنال‌های دیجیتالی تبدیل می‌کند که توسط کامپیوتر قابل خواندن است.

رایج‌ترین لیزرهای مورد استفاده در فلوسیتومترهای سنتی 488نانومتر (آبی)، 405 نانومتر(بنفش)، 532 نانومتر (سبز)، 552 نانومتر (سبز)، 561 نانومتر (سبز_زرد)، 640 نانومتر (قرمز)، 355 نانومتر (فرابنفش) هستند. طول موج‌ لیزر اضافی برای کاربردهای تخصصی موجود است.

همچنین بخوانید:استفاده از کریسپر در تشخیص بیماری

• سیتومترهای فوکوس آکوستیک

این سیتومتر از امواج اولتراسونیک برای تمرکز بهتر سلول‌ها برای بازجویی لیزری استفاده می‌کند. این نوع فوکوس صوتی امکان ورودی نمونه بالاتر و گرفتگی کمتر نمونه را فراهم می‌کند. این سیستومتر می‌تواند از 4 لیزر و 14 کانال فلورسانس استفاده کند.

• مرتب‌کننده‌های سلولی

نوع خاصی از فلوسایتومتر سنتی هستند که می‌توانند نمونه‌ها را برای تجزیه‌وتحلیل بیشتر خالص‌سازی و جمع‌آوری کنند. مرتب‌سازی سلولی به کاربر اجازه می‌دهد تا جمعیتی از سلول‌ها یا ذرات که برای پارامترهای موردنظر مثبت یا منفی است، انتخاب و سپس آن سلول‌ها را به یک ظرف جمع‌آوری هدایت کند. مرتب‌کننده سلول، سلول‌ها را با نوسان دادن جریان نمونه مایع در فرکانس بالا برای تولید قطرات جدا می‌کند. سپس به قطرات بار مثبت و منفی داده می‌شود و از صفحات انحراف فلزی عبور می‌کنند و بر اساس بار خود به یک ظرف جمع‌آوری خاص هدایت می‌شوند. مخازن جمع‌آوری می‌توانند لوله، اسلاید و یا صفحه‌ باشند.

• سیتومترهای تصویربرداری

فلوسیتومترهای تصویربرداری (IFC) فلوسیتومترهای سنتی را با میکروسکوپ فلورسانس ترکیب می‌کنند. این امر امکان تجزیه‌وتحلیل سریع نمونه را برای مورفولوژی و فلورسانس چند پارامتری در سطح تک‌سلولی و جمعیتی فراهم می‌کند. IFC می‌تواند توزیع پروتئین‌ها را در سلول‌های منفرد مانند میکروسکوپ کانفوکال یا فلورسانس و همچنین برای پردازش تعداد زیادی سلول مانند فلوسایتومتر ردیابی کند. آن‌ها به‌ویژه در کاربردهای متعددی مانند سیگنال‌دهی سلولی، مطالعات محلی‌سازی مشترک، برهم کنش سلول به سلول، آسیب و ترمیم DNA و هر برنامه کاربردی که نیاز به هماهنگی مکان سلولی با بیان فلورسانس در جمعیت‌های بزرگ سلولی دارد مفید هستند.

مزایا و معایب تکنیک فلوسایتومتری

• تمام موارد را مشخص می‌کند

استفاده از فلوسیتومتری برای مشاهده جمعیت سلولی یکنواخت این مزیت را دارد که همیشه هر گونه غیریکنواختی را برجسته می‌کند. همچنین هنگام ارائه داده‌های نهایی هر گونه زباله یا سلول‌های مرده را ازبین می‌برد.

• معمولا غیرضروری هستند

هنگام مطالعه یک جمعیت یکنواخت از سلول‌ها معمول است که داده‌های موردنظر تراکم متوسط گیرنده باشد. فلوسایتومتری می‌تواند به راحتی این کار را انجام دهد اما گران‌تر از جایگزین‌هایی مانند رادیو ایمونواسی و سنجش ایمونوسوربنت است. این تکنیک همچنین مقدار قابل‌توجهی از اطلاعات را که نیاز نیست، ارائه می‌دهد.

• خیلی کند هستند

سورترهای فلوسایتومتری بسیار دقیق هستند و زیر جمعیت‌های کوچک یا پیچیده را خالص می‌کنند. اما حتی یک مرتب‌کننده با سرعت بالا نیز در مواقعی به اندازه کافی سریع نیست تا به نتیجه دلخواه برسد. به‌عنوان مثال هنگامی که با زیرجمعیتی که 20درصد کل جمعیت را تشکیل می‌دهد، یک مرتب‌کننده پرسرعت می‌تواند تا 106 سلول در ساعت تولید کند؛ این نرخ برای بسیاری از آزمایشات بسیار پایین است.

جمع‌بندی

فیلوسایتومتری فناوری است که به سرعت تک سلولی یا ذرات را هنگامی‌که از کنار لیزرهای منفرد یا چندگانه عبور می‌کنند (درحالی که در محلول بافری مبتنی بر نمک معلق هستند)، تجزیه‌وتحلیل می‌کند. هنگامی‌که تست فلوسیتومتری کامل شود، یک پاتولوژیست نتایج فلوسیتومتری شما را تفسیر می‌کند و یافته‌های خود را در یک گزارش آزمایشگاهی جامع قرار می‌دهد. پاتولوژیست شما نتایج آنالیز فلوسیتومتری و همچنین سابقه‌ی پزشکی، علائم و آخرین معاینه فیزیکی را درنظر می‌گیرد. تاکنون هیچ خطر شناخته شده‌ای برای تست فلوسیتومتری وجود ندارد.

نویسنده: کوثر حاجی‌پور

منابع

Link1:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5939936

Link2:https://my.clevelandclinic.org/health/diagnostics/22086-flow-cytometry

Link3:https://sciencing.com/advantages-disadvantages-flow-cytometry-10050486.html