فهرست مطالب
یکی از مهم‌ترین میکروسکوپ‌های مورد استفاده در علوم بیولوژیکی میکروسکوپ فلورسانس است. این میکروسکوپ دارای ویژگی‌های منحصربه‌فردی است، که موجب تمایز آن از دیگر انواع میکروسکوپ‌ها می‌شود.
میکروسکوپ فلورسانس منبع نوری با شدت بسیار بالا (نور فرابنفش) را به‌کار می‌گیرد که بخش‌های فلورسنت را در نمونه مورد نظر، تحریک می‌کند. این بخش‌های فلورسنت بازتابی با انرژی کمتر و طول موجی بلندتر از خود ساطع می‌کند که در این حالت تصویری با بزرگ‌نمایی مناسب از نمونه ایجاد می‌شود. این ویژگی به محققان توانایی مشاهده اندامک‌های موردنظر یا ویژگی‌های منحصربه‌فرد سطح نمونه مورد بررسی را می‌دهد.
به‌طورکلی از میکروسکوپ‌های فلورسانس برای موارد زیر استفاده می‌شود:
- تصویربرداری از اجزای ساختاری نمونه‌های کوچک مانند سلول
- انجام مطالعات زیست‌پذیری در مورد جمعیت‌های سلولی
- تصویربرداری از مواد ژنتیکی درون سلول DNA و RNA
- مشاهده سلول‌های خاص در یک جمعیت بزرگ‌تر با تکنیک‌هایی مانند FISH
کار با میکروسکوپ فلورسانس
اغلب، در ابتدا نمونه مورد بررسی با ماده فلورسنت یا فلوئوروفور نشان‌دار می‌شود.
سپس از طریق عدسی با منبع نوری انرژی بالا، مورد تابش قرار می‌گیرد. این نور توسط فلوئوروفورها جذب شده و باعث می‌شود که آن‌ها نور را با انرژی کمتر و طول موج بیشتر بازتاب کنند.
این نور فلورسنت با استفاده از فلیترهایی که برای طول موج خاص طراحی شده‌اند، جدا می‌شوند و به بیننده اجازه می‌دهد تا تنها آنچه که دارای فلورسانس است را ببیند.
وظیفه اصلی میکروسکوپ فلورسانس این است که اجازه می‌دهد، پرتو نور بر نمونه مورد نظر بتابد و سپس نور بازتاب شده از نمونه با انرژی کمتر را جمع‌آوری کند. میکروسکوپ فیلتری دارد که فقط اجازه تابش پرتویی خاص با طول موج مشخصی که با ماده فلورسنت مورد استفاده، مطابقت دارد را می‌دهد. تابش این اشعه با اتم‌های درون نمونه برخورد کرده و الکترون‌های موجود در آن را برانگیخته می‌کند و به سطح انرژی بالاتر میبرد. زمانی که این الکترون‌ها به حالت استراحت برمی‌گردند، به سطح پایین‌تری از انرژی می‌رسند و از خود نور ساطع می‌کنند. برای قابل تشخیص شدن این نور (قابل مشاهده برای چشم انسان)، فلورسانس ساطع شده از نمونه، از یک نور تحریکی روشن‌تر در فیلتر دوم جدا می‌شود. این کار به این دلیل انجام می‌شود که نور ساطع شده دارای طول موج بلندتر و انرژی کمتری نسبت به نور روشن کننده سطح است.
آماده‌سازی نمونه
نحوه‌ی آماده‌سازی نمونه برای مشاهده با میکروسکوپ فلورسانس برای نمونه‌های مختلف متفاوت است. مثلا:
تهیه نمونه با پروتئین‌های فلورسنت (پروتئین‌های فلورسنت سبز)
پروتئین‌های فلورسنت سبز (GFPs) که از چتر دریایی«Aequorea Victoria» گرفته شده به‌عنوان یک برچسب فلورسنت، برای تصویربرداری از پروتئینها در سلول‌ها استفاده می‌شوند. تنوع طیفی این پروتئین‌های فلورسانس جهش‌یافته بدان معنی است که تصویربرداری همزمان چندین پروتئین در یک سلول قابل انجام است. از این پروتئینها برای سایر تکنیک‌های تصویربرداری از سلول‌های زنده نیز استفاده شده‌است. ژن پروتئین‌های فلورسنت سبز درون DNA گنجانده شده که پروتئین‌های مورد مطالعه را کد می‌کنند. از آنجا که رونویسی و ترجمه این ژن‌ها هم توسط سیستم سلولی کنترل می‌شود، بنابراین هنگامی که ژن در آن ناحیه از DNA بیان شود؛ ژن پروتئین‌های فلورسنت سبز همزمان بیان شده و پروتئین‌های نشان‌داری تولید می‌شوند.
تهیه نمونه با پروتئین‌های فلورسنت (آنزیم‌های نشان‌دار)
روش دیگر نشان‌دار کردن پروتئینها از طریق آنزیم‌های خود نشان‌دار، به نام نشانگرهای Halo یا نشانگرهای SNAP / CLIP است. آنزیم‌های خود نشان‌دار می‌توانند به صورت کووالانسی به یک لیگاند فلورسنت از قسمت باقی‌مانده اسیدآمینه‌ی آن بچسبند که اندازه‌ای مشابه با پروتئین‌های فلورسانس دارند. پروتئین‌های بیان شده از این نوع در واقع فلورسنت نیستند و فقط زمانی که در معرض فلورسانس قرار می‌گیرند، پرتوهای فلورسانس از خود ساطع می‌کنند. در مقایسه با نشان‌دار کردن پروتئین‌های فلورسانس، این روش از مزیت امکان نشان‌دار کردن‌های پی‌درپی برخوردار است. از تکنیک آنزیم‌های نشان‌دار برای بررسی فرآیند سلولی در طول زمان نیز استفاده می‌شود. استفاده از آنزیم‌های نشان‌دار همچنین مکان ردیابی جمعیت پروتئین‌های مختلف را طی یک دوره زمانی فراهم می‌کند.
نتیجه‌گیری
امروزه بیشتر میکروسکوپ‌های فلورسانس مورد استفاده در زیست‌شناسی، میکروسکوپ‌های اپی‌فلورسانس هستند، به این معنی که هم تحریک و هم مشاهده فلورسانس در قسمت بالای نمونه اتفاق می‌افتد. بیشتر آن‌ها از لامپ تخلیه قوس زنون یا مرکوری برای منبع نور قوی‌تر استفاده می‌کنند. تغییرات میکروسکوپ‌های اپی‌فلورسنت و ظهور منابع نور متمرکز قدرتمندتر مانند لیزرها در آن‌ها، باعث شده‌است که میکروسکوپ‌هایی با تکنیک‌های پیشرفته‌تر به‌دست بیایند.
نویسنده: زهرا سروآزاد
منابع:
- https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/fluorescence/fluorhome/
- https://microbenotes.com/fluorescence-microscope-principle-instrumentation-applications-advantages-limitations/
- https://www.biotek.com/products/imaging-microscopy/?Product_Interest_Source=Marketing%20Campaign&source=Marketing%20Campaign&Lead_Campaign_Source=7011O000002TCTe&Campaign_Source=7011O000002TCTe&utm_source=biotek&utm_medium=cpc&utm_campaign=7011O000002TCTe&gclid=CjwKCAiAxJSPBhAoEiwAeO_fP8ZSWZdocCrr2LPVN7aPKBPsEdHQ0GYbwQQbl6b4oaIK3GY57saslBoCELYQAvD_BwE
