DNA روشی برای سلامتی

توالی DNA به روش­های MLPA & CGH

سیتوژنتیک علمی است که به مطالعه­­ ی ساختارهای سلولی به­ ویژه تغییرات عددی و ساختاری کروموزوم­ ها می­ پردازد. بسیاری از اختلالات ژنتیکی انسان ناشی از ناهنجاری­ های نامتعادل کروموزومی است که در آنها دو برابر ­شدگی یا از بین رفتن خالص محتوای ژنتیکی وجود دارد.

 Multiplex ligation-dependent probe amplification یکی از جدیدترین روش­های مولکولی، برای تشخیص سریع و دقیق تعداد نسخه ­های ژنی و جهش­ های نقطه ­ای، در طیف وسیعی از بیماری­های ژنتیکی انسانی است. این روش قادر به سنجش تعداد DNA و بررسی تعداد نسخه­ های ژنی در 50 تا 60  محل مختلف، در یک واکنش ساده­ی PCR می­باشد. در این روش با طراحی مجموعه­ای از پروب­ ها که هر کدام مکمل ناحیه­ ای مشخصی از ژنوم هستند، تعداد نسخه ژنی در یک منطقه را می­توان مشخص کرد. اساس این روش بر پایه هیبرید شدن هر جفت پروب با توالی مشخصی در ژنوم، به­ صورت اختصاصی است. به­ طوری که حتی تغییر یک نوکلئوتید در محل اتصال 2 پروب، قابل شناسایی است و از این خصوصیت می­توان برای طراحی پروب­ های اختصاصی جهت بررسی جهش­ های نقطه­ ای شناخته­ شده نیز استفاده کرد.

کاربردهای روش MLPA

• بررسیdel/dup در ژنوم به ­ویژه:

      del/dup بزرگ با محدوده­ی نامشخص

      del/dup در برگیرنده­ی اگزون­ های متعدد مانند بررسی ژن دیستروفین در افراد مشکوک به دیستروفی عضلانی دوشن (با این روش علاوه بر تشخیص بیماران، به سادگی می­توان ناقلین را شناسایی کرد.)

• بررسی تعداد نسخه­ ای ژنی در محل­ های خاصی در کروموزوم­های مختلف جهتscreening  ژن­های مختلف.
• بررسی جهش­ های نقطه ­ای و پلی­ مورفیسم­ های شناخت هه شده.
• بررسی کمی mRNA
• بررسی وضعیت متیلاسیون مناطق پروموتری و یا imprinted
• بررسی DNA استخراج شده از بافت (paraffin imbedded یا formalin treated)

مراحل واکنش MLPA

واکنش  MLPAرا می­توان به پنج مرحله تقسیم کرد:

1. دناتوراسیون DNA و هیبریداسیون پروب
2. لایگیشن (اتصال) DNA
3. تکثیر به­وسیله PCR­
4. جداسازی محصولات PCR توسط الکتروفورز
5. تجزیه ­و تحلیل داده­ ها

 ابتدا، DNA واسرشت­شده و پروب ­های MLPA به DNA متصل می­شوند.

دو نیم پروب، قادر به تشخیص توالی ­های هدف خاصی هستند. این توالی باید بسیار اختصاصی بوده و دارای تطابق کامل با پروب­ ها و بدون یک گپ باشد.

پس از هیبریداسیون، PCR انجام می­شود. چون فقط پروب­ های متصل­شده در طول واکنش PCR بعدی تکثیر می­شوند، اندازه­ گیری تعداد محصولات اتصال پروب، برابر تعداد توالی هدف در نمونه است.

در انتها محصولات PCR با استفاده از تکنیک الکتروفورز، از نظر اندازه جدا می­شوند.

 comparative genomic hybridization(CGH)

 CGH روشی با قدرت تفکیک بالا برای بررسی حذف­ها و یا اضافه­ شدگی­ ها در کل ژنوم و شناسایی عدم تعادل کروموزومی است. این آزمایش را کاریوتیپ مولکولی هم می نامند. همچنین به­ طور ویژه برای شناسایی علل عقب­ ماندگی­ های ذهنی یا ناهنجاری­ های مادرزادی کاربرد دارد. این آزمایش را می­توان جایگزین روش­ های قدیمی مطالعه­ی کروموزمی و تعیین کاریوتیپ در بعضی موارد کرد. اساس این آزمایش مقایسه هیبرید­ شدگی ژنوم در توالی ژن است.

مراحل واکنش CGH

ابتدا DNA از یک نمونه (به ­عنوان مثال خون یا پوست) استخراج می­شود.

 DNAمورد آزمایش با یک رنگ فلورسنت برچسب­ گذاری شده، در حالی که DNA مرجع با یک رنگ دیگر برچسب ­گذاری می­شود.

دو DNA ژنومی (تست و مرجع) با هم مخلوط و روی اسلاید شیشه­ای توالی ژن هیبرید می­شوند. از آنجا که DNA واسرشت شده­ است، تک رشته­ ای هستند. بنابراین، هنگامی که به اسلاید منتقل می­شوند، با پروب­ های تک ­رشته ای هیبرید می­شوند.

در انتها از سیستم ­های تصویربرداری دیجیتال برای ضبط و اندازه­گیری شدت نسبی فلورسانس پروب­های DNA برچسب ­خورده استفاده می­شود. نسبت فلورسانس سیگنال ­های هیبریداسیون مرجع آزمایش در موقعیت ­های مختلف، در امتداد ژنوم تعیین می­شود و اطلاعات مربوط به تعداد کپی نسبی توالی­ های موجود در ژنوم آزمون را در مقایسه با ژنوم معمولی ارائه می­دهد.

مقایسه ی  دو روش MLPA & CGH

مزایای :MLPA

تشخیص بازسازی­های کوچک، تشخیص همزمان حداکثر 40 هدف، توان بالا در بررسی جهش­ های نقطه ­ای در متیله شدن و تعداد نسخه در یک آنالیز، هزینه کم، نیاز به نمونه اندک به­عنوان الگو 20 تا 100 نانوگرم، عدم نیاز به کشت سلول.

معایب  :MLPA

عدم تشخیص کپی­ های خنثی در هتروزیگوسیتی، عدم توانایی در تشخیص موزاییسم (هتروژنی تومور)، آلودگی با سلول­های سالم و عدم تشخیص درست، وقت­ گیر، پیچیده ­بودن و هزینه­ های بالای تهیه پروب.

مزایای  :CGH

می­تواند بازسازی­ های بسیار کوچک را تشخیص دهد، امکان بررسی کل ژنوم با پروب وجود دارد، هزینه کم به­ ازای داده­ های خروجی.

معایب CGH:

تجهیزات گران قیمت، عدم تشخیص کپی­ های خنثی در هتروزیگوسیتی، بازده پایین در تشخیص­ های پیش­از تولد، مشخص نبودن تفسیر نتایج تغییرات کروموزومی به­ طور دقیق.

نتیجه ­گیری:

با توجه به مزایای روش MLPA، کاربرد آن در زمینه بررسی مولکولی بیماری­ های مختلف در حال گسترش است. اکنون MLPA در زمینه شناسایی ناقلین و تشخیص افراد مبتلا به بیماری­ های ژنتیک مختلف، به­خصوص بیماری­های ناشی از جهش­ های حذفی بزرگ و با محدوده ژنی متنوع مثل آلفا تالاسمی، بتا تالاسمی و دیستروفی عضلانی دوشن و… به­کار می­رود.

همچنین برخلاف تکنیک ­های سنتی استفاده­ شده برای تشخیص  تعداد کپی ­ها، که به بررسی  و دانش قبلی ناحیه مورد بررسی متکی بود، CGH می­تواند برای اسکن سریع کل ژنوم برای بررسی عدم تعادل تعداد ژنی استفاده شود. علاوه ­بر این، CGH بهگستره­ی سلول­های متافازی (در حال تقسیم) نیاز ندارد. با این حال، مانند روش­ های قبلی سیتوژنتیک، وضوح CGH برای بیشتر کاربردهای بالینی محدود به تغییرات 5-10 مگابایت است.

منابع:

منیع1

منبع2

منبع3

منبع4

منبع5