تست کوآگولاز

مقدمه:

کواگولاز(Coagulase) نوعی آنزیم پروتئینی است که به وسیله ریزاندام به وجود می‌آیدو در تبدیل فیبرینوژن به فیبرین نقش مهمی را ایفا می‌کند. در آزمایشگاه‌ها از وجود یا عدم وجود کواگولاز در تشخیص بین انواع گوناگون استافیلوکوک استفاده می‌کنند. این پروتئین همچنین از یرسینیا پستیس نیز تهیه می‌گردد.

کاربردهای تست آزمایش کواگولاز و DNase پروتکل انجام آزمایش:

این تست در آزمایشگاه­های تشخیص طبی کاربرد دارد و با استفاده از آن می­توان استافیلوکوک­های بیماریزا (کواگولاز مثبت) را از سویه­های غیر بیماری­زا (کواگولاز منفی) افتراق داد. آنزیم کواگولاز با مکانیسمی شبیه مکانیسم اصلی لخته شدن، پلاسمای خون را لخته می­کند. هرچند حضور آنزیم کواگولاز برای بیماری­زایی ضروری نیست، ولی شاخص خوبی برای شناسایی باکتری­های بالقوه پاتوژن استافیلوکوک اورئوس می­باشد. باکتری­های تولید کننده کواگولاز رشته­های فیبرینی در اطراف خود تنیده و از سیستم ایمنی میزبان فرار می­کنند. در عفونت­های استافیلوکوکی ایجاد لخته فیبرینی باعث محدود شدن یا موضعی شدن عفونت می­شود.

آنزیم کواگولاز به دو شکل کواگولاز متصل و آزاد وجود دارد:

کواگولاز متصل (Bound Coagulase) به دیواره سلولی باکتری متصل است. برای بررسی فعالیت آنزیم کواگولاز متصل، آزمون کواگولاز لامی(Silde test) بکار می­رود. فعالیت کواگولاز متصل با آنتی بادی تولید شده بر علیه کواگولاز آزاد مهار نمی­شود.

کواگولاز آزاد (Free Coagulase) ترکیبی شبیه ترومبین است که توسط باکتری تولید و در محیط آزاد می­شود. کواگولاز آزاد به واسطه فاکتور فعال کننده کواگولاز در پلاسما به آنزیمی کارآمد تبدیل شده و با روشی مشابه ترومبین، لخته فیبرین ایجاد می­کند.

در تست کواگولاز، استافیلوکوک­های کواگولاز مثبت با استفاده از این آنزیم پلاسما ار لخته می­کند. در این آزمایش پلاسمای مورد استفاده بوسیله سیترات یا EDTA از نظر لخته شدن غیر فعال می­شود تا تداخلی در آزمایش ایجاد نکند. علاوه بر آنزیم کواگولاز، اکثر گونه های بیماری­زای استافیلوکوک آنزیم DNase تولید می­کنند. این آنزیم با تجزیه DNA سلول­های میزبان ویرولانس باکتری را افزایش می­دهد. برای نشان دادن حضور DNase، باکتری را در محیط حاوی DNA کشت می­دهند. وجود هاله شفاف در اطراف کلونی باکتری بیانگر مثبت شدن تست DNase است. این هاله در نتیجه تجزیه مولکول­های درشت DNA توسط آنزیم DNase و حل شدن محصول نهایی در اسید اضافه شده به محیط به وجود می­آید. DNA تجزیه نشده در اسید ضعیف حل نمی­شود، بلکه به وسیله آن رسوب می­کند، بنابراین محیط اطراف کلونی که از نظر DNase منفی است، کدر دیده می­شود.

دستورالعمل/روش انجام تست کواگولاز

برای انجام این آزمون به پلاسما تازه انسان یا خرگوش نیاز است. بهتر است برای آزمون کواگولاز از پلاسمای سیتراته استفاده نشود، زیرا باکتری­هایی که توانایی مصرف سیترات را دارند در اثر اکسیداسیون آن، کلسیم متصل به سیترات را آزاد می­کنند و کلسیم در مسیر انعقاد طبیعی خون باعث تشکیل لخته فیبرینی می شود. بنابراین در نتیجه تست تداخل ایجاد شده و نتیجه تست مثبت کاذب بدست می آید.

تست کواگولاز:

روش انجام تست کواگولاز اسلایدی:

1. یک قطره از پلاسما بر روی لام یا اسلاید شیشه‌ای خشک و تمیز قرار داده می‌شود.

یک قطره آب مقطر و یا سرم فیزیولوژی در نقطه مجزایی (به‌عنوان کنترل) گذارده می‌شود.

با یک لوپ یا سواپ استریل مقداری از کلنی را در هر یک از قطرات فوق، امولوسیون می‌کنیم تا سوسپانسیون یکنواختی تهیه شود.

2. از نظر تشکیل لخته در محل پلاسما و سوسپانسیون یکنواخت در محل کنترل بررسی می‌کنیم.

اگر تشکیل لخته در هر دونقطه انجام شود نشان‌دهنده اتواگلوتیناسیون ارگانیسم است و بایستی تست کواگولاز تکرار شود.

بررسی نتایج:

استافیلوکوک اورئوس موجب تجمع سریع و لخته قابل ‌مشاهده‌ای در سطح لام می‌شود.

استافیلوکوک اپیدرمیس هیچ لخته‌ای را ایجاد نمی‌کند و سوسپانسیون در شکل یک محلول شیری‌رنگ صاف و یکنواخت باقی می‌ماند.

روش انجام تست کواگولاز لوله‌ای:

1. معرف تست کواگولاز را تهیه می‌کنیم. به‌این‌ترتیب که مقدار ۰٫۵ میلی‌لیتر از پلاسمای انسان یا خرگوش (حاوی ماده ضد انعقاد EDTA) را در لوله‌آزمایش پلاستیکی یا شیشه‌ای می‌ریزیم. این پلاسما در دمای یخچال برای ۱۰ روز و در دمای ۲۰- درجه برای چند ماه قابل نگهداری است.
2. پلاسما را به میزان ۱ به ۴ رقیق کرده و سوسپانسیونی از باکتری را در آن تهیه می‌کنیم.
3. این سوسپانسیون را برای ۴-۱ ساعت در دمای ۳۷-۳۵ درجه نگهداری کرده و از نظر تشکیل لخته بررسی می‌کنیم. اگر در مدت ۴ ساعت، لخته تشکیل نشد برای یک‌شب در حرارت باقی می‌گذاریم.

ارگانیسم‌هایی که نتوانند پلاسما را در مدت ۲۴ ساعت لخته کنند به‌عنوان کواگولاز منفی در نظر گرفته می‌شوند.

بررسی نتایج:

استافیلوکوک اورئوس، پلاسما را در مدت ۲۴ ساعت لخته می‌کند اما استافیلوکوک اپیدرمیس حتی بعد از یک‌شب، توانایی لخته کردن پلاسما را ندارد.

استافیلوکوکوس اورئوس

استافیلوکوک اورئوس ( Staphylococcus aureus)، کوکسی گرم مثبت و بی‌هوازی اختیاری است که مهم‌ترین گونه در جنس (سرده) استافیلوکوک از نظر پزشکی محسوب می‌شود. گاهی اوقات به این باکتری، استافیلوکوک طلایی نیز می‌گویند. اورئوس در زبان لاتین به معنای طلایی است.

این باکتری ممکن است به شکل فلور عادی پوست یا بینی وجود داشته باشد. این طور تخمین زده می‌شود که ۲۰ درصد از مردم به مدت طولانی، ناقل باکتری باشند. استافیلوکوک اورئوس، یکی از موفق‌ترین باکتری‌های بیماری­زا است. این باکتری به دلیل تولید رنگدانه طلایی کارتنوئیدی به نام استافیلوزانتین(staphyloxanthin)، کلنی‌های زرد رنگی را ایجاد می‌نماید. این پیگمان در بیماری‌زایی نقش دارد زیرا به عنوان ماده آنتی اکسیدان عمل کرده و موجب در امان ماندن باکتری در برابر رادیکال‌های آزاد اکسیژن می‌شود. رادیکال‌های آزاد اکسیژن توسط سیستم ایمنی (گلبول‌های سفید) میزبان برای کشتن باکتری‌ها تولید می‌شوند.

استافیلوکوک اورئوس، گستره وسیعی از عفونت‌ها از عفونت‌های ساده پوستی (مانند جوشدانه، کورک، کفگیرک، گل مژه و آبسه) گرفته تا بیماری‌های تهدیدکننده زندگی (مانند پنومونی، مننژیت، استئومیلیت، اندوکاردیت، سندرم شوک سمی و سپتی سمی) را ایجاد می‌نماید. استافیلوکوک اورئوس به عنوان یکی از ۵ عامل شایع ایجادکننده عفونت‌های بیمارستانی به ویژه عفونت‌های زخم پس از جراحی است. هر سال، ۵۰۰ هزار نفر در بیمارستان‌های ایالات متحده آمریکا به عفونت‌های ستافیلوکوک اورئوس مبتلا می‌شوند.

میکروب شناسی

استافیلوکوک اورئوس، کوکسی گرم مثبت و بی‌هوازی اختیاری است که به شکل خوشه در زیر میکروسکوپ دیده می‌شود. کلنی باکتری، به شکل زرد طلایی است و هنگامیکه بر روی محیط آگار خوندار رشد می‌کند، ایجاد همولیز می‌نماید.این باکتری، آنزیم کاتالاز را تولید می‌کند. آنزیم کاتالاز موجب تجزیه پراکسید هیدروژن (H2O2) به آب و اکسیژن می‌شود. تست کاتالاز برای تمایز استرپ از استاف هم قابل استفاده است.این تست برای تمایز استافیلوکوک‌ها از استرپتوکوک‌ها و انتروکوک‌ها استفاده می‌شود. استافیلوکوک اورئوس، آنزیم کواگولاز را تولید می‌کند. آین آنزیم، خون را لخته می‌کند. سایر گونه‌های استافیلوکوک از نظر کواگولاز منفی هستند اما استثنا استافیلوکوک‌های دلفینی و شلیفری و هلیکوس و اینترمدیوس هم دارای کواگولاز مثبت هم است.

نقش در بیماری:استافیلوکوک اورئوس با تولید انتروتوکسین، ایجاد مسمومیت غذایی می‌کند. باکتری ممکن است به شکل همزیست بر روی پوست وجود داشته باشد و از بینی یک سوم از مردم جدا شود. این باکتری به میزان کمتر ممکن است در گلو نیز وجود داشته باشد. وجود استافیلوکوک اورئوس در این شرایط به معنای عفونت نیست و نیازی هم به درمان در اینگونه موارد نمی‌باشد. باکتری ممکن است در حیوانات اهلی، گربه‌ها، سگ‌ها و اسب‌ها وجود داشته باشد و موجب التهاب و عفونت پا در مرغ‌ها شود. استافیلوکوک اورئوس ممکن است بر روی سطوح خشک برای هفته‌ها تا ماه‌ها زنده بماند. برخی از فاژها (باکتریوفاژها) می‌توانند استافیلوکوک اورئوس را آلوده کنند و از این طریق موجب انتقال ژن تولیدکننده توکسین پنتون- والنتین به آن شوند. از این رو، بیماریزایی سویه‌ها را افزایش خواهند داد.

هنگامی که سد پوستی از بین برود، باکتری به بافت حمله می‌کند و بیماری‌هایی مانند کورک و کفگیرک را ایجاد می‌کند. استافیلوکوک اورئوس در کودکان، عفونت شدید به نام سندرم پوستی فلسی شونده استافیلوکوکی(staphylococcal scalded skin syndrome) را ایجاد می‌کند.

عفونت‌های استافیلوکوکی از طریق تماس با چرک زخم یا پوست با پوست انتقال پیدا می‌کنند. تماس با وسایل شخصی مانند حوله، ملحفه، لباس و وسایل ورزشی نیز در انتقال عفونت از فردی به فرد دیگر نقش دارند. عفونت‌های عمیق ممکن است شدید باشند مانند آرتریت سپتیک، اندوکاردیت و پنومونی.

درماتیت آتوپیک:

این باکتری یکی از عوامل درماتیت آتوپیک است. جوشدانه‌ها بیشتر در زیر بغل، فرق سر و موها دیده می‌شوند. این حالت ممکن است به صورت سندرم پوستی فلسی شونده درآید. حالت بسیار شدیدتر به نام سندرم ریتر (Ritter’s disease) یا پمفیگوس نئوناتوروم (Pemphigus neonatorum) در نوزادان دیده شده‌است.

سندرم شوک سمی:سویه‌هایی که اگزوتوکسین TSST-1 را تولید می‌کنند ممکن است موجب بیماری بالقوه مهلک و کشنده‌ای به نام سندرم شوک سمی (Toxic shock syndrome) شوند. استرپتوکوک پیوژنز نیز ممکن است سندرم مشابه‌ای به نام سندرم شوک سمی استرپتوکوکی را ایجاد کند. علائم بیماری شامل تب بالا، کاهش فشار خون، ناخوشی، گیجی و در نهایت از کار افتادن اندام‌های داخلی بدن انسان، کما و مرگ است. راش‌های شبیه آفتاب سوختگی در مراحل اولیه بیماری در لب، چشم، دهان، کف دست و پا دیده می‌شوند. در صورت درمان،بیمار پس از چند هفته، سلامتی خود را بازمی‌یابد در غیر این صورت، در عرض چند ساعت خواهد مرد. این سندرم به میزان ۳ تا ۴ مورد از هر ۱۰۰هزار زنی که ازتامپون‌ واژنی در قاعدگی استفاده می‌کنند، دیده شده‌است. در صورت راهیابی باکتری به واژن، در حضور تامپون در آنجا تکثیر پیدا کرده و توکسین TSST-1 را تولید می‌کند.توکسین از آنجا وارد خون می‌شود و در سرتاسر بدن پخش خواهد شد.این آمار مربوط به امریکاست. سندرم شوک سمی غیر از این موارد مثلاً ناشی از عفونت‌های زخم بسیار نادر است.

مسمومیت غذایی:

استافیلوکوک اورئوس با تولید انتروتوکسین در غذا موجب گاستروانتریت و مسمومیت غذایی می‌شود. مسمومیت غذایی خود محدود شونده است و به درمان خاصی نیاز ندارد. بیمار پس از ۸ تا ۲۴ ساعت بهبود پیدا می‌کند. علائم مسمویت غذایی شامل اسهال، استفراغ و درد شکمی است.

ورم پستان در گاو:

استافیلوکوک اورئوس موجب ماستیت (وروم پستان) در گاو می‌شود. کپسول پلی ساکاریدی آن، موجب عدم شناسایی باکتری توسط سیستم ایمنی گاو می‌شود.

فاکتورهای بیماری زایی

آنزیم‌ها:

باکتری، آنزیم‌های مختلفی را تولید می‌کند. کواگولاز موجب لخته شدن خون و در نتیجه عدم فاگوسیت شدن توسط گلبول‌های سفید می‌شود. هیالورونیداز، اسید هیالورونیک موجود در بافت همبند را تجزیه کرده و موجب گسترش باکتری در بدن می‌شود. استافیلوکوک اورئوس، آنزیم دزوکسی ریبونوکلئاز (DNAse) را تولید می‌کند که DNA را تجزیه می‌کند.

توکسین‌ها:

باکتری توکسین‌های مختلفی را تولید می‌کند که هریک بیماری‌های خاصی را ایجاد می‌کند. توکسین TSST-1 در ایجاد سندرم شوک سمی نقش دارد. انتروتوکسین‌ها در مسمومیت غذایی نقش دارند. TSST-1 و انتروتوکسین‌ها، سوپرآنتی ژن هستند. توکسین فلسی‌کننده (Exfoliative toxin) موجب سندرم پوستی فلسی شونده استافیلوکوکی می‌شود. این توکسین نوعی پروتئاز است که پوست را تجزیه می‌کند.استافیلوکوک اورئوس، توکسین‌های دیگری مانند توکسین آلفا، توکسین بتا و توکسین گاما را تولید می‌کند که موجب تجزیه غشای بسیاری از سلول‌های بدن می‌شود. توکسین پنتون- والنتین، پنومونی نکروز دهنده شدید در کودکان ایجاد می‌نماید. ژن توکسین اخیر بر روی باکتریوفاژ قرار دارد که از طریق آلوده شدن باکتری به فاژ، به آن انتقال پیدا می‌کند. توکسین پنتون- والنتین، بیشتر در سویه‌های MRSA اکتسابی از جامعه (CA-MRSA) دیده شده‌است.

پروتئین A:

پروتئین A از طریق آنزیم ترانسپپتیدازی به نام سورتاز به پپتیدوگلیکان (دیواره سلولی باکتریایی) متصل می‌شود. پروتئین A به قسمت Fc از آنتی بادی IgG(به جز igg3) متصل می‌شود. جهش در ژن پروتئین اخیر موجب کاهش بیماریزایی باکتری می‌شود. از پروتئین A در تخلیص گستره وسیعی از آنتی بادی‌ها در کروماتوگرافی استفاده شده‌است.

پیگمان:این باکتری به دلیل تولید رنگدانه طلایی کارتنوئیدی به نام استافیلوزانتین(staphyloxanthin)، کلنی‌های زرد رنگی را ایجاد می‌نماید. این پیگمان در بیماری زایی نقش دارد زیرا به عنوان ماده آنتی اکسیدان عمل کرده و موجب در امان ماندن باکتری در برابر رادیکال‌ های آزاد اکسیژن می‌شود.

نتیجه:

می­توان گفت که تست کوآگولاز یکی از حساس­ترین تست­های آزمایشگاهی می­باشد و عدم دقت در انجام این تست می­تواند برای بیمار خطرآفرین باشد. رعایت نکاتی مانند استفاده از پلاسمای لوله­های CBC و عدم استفاده از پلاسمای لوله­های ESR می­تواند بسیار موثر باشد و جواب درست­تری را به بیمار دهد.

منابع:

1)Kluytmans J, van Belkum A, Verbrugh H (July 1997). “Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks”. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3): 505–20. PMC 172932. PMID 9227864.

2)Clauditz A, Resch A, Wieland KP, Peschel A, Götz F (August 2006). “Staphyloxanthin plays a role in the fitness of Staphylococcus aureus and its ability to cope with oxidative stress”. Infection and immunity 74 (8): 4950–3. doi:10.1128/IAI.00204-06. PMC 1539600. PMID 16861688.

3)Bowersox, John (27 May 1999). “Experimental Staph Vaccine Broadly Protective in Animal Studies”. NIH. Archived from the original on 5 May 2007. Retrieved 28 July 2007.

4)Ogston A (1984). “”On Abscesses”. Classics in Infectious Diseases”. Rev Infect Dis 6 (1): 122–28. PMID 6369479.

5)Ryan KJ, Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed.). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9.

6)Whitt, Dixie D. ; Salyers, Abigail A. (2002) [2002]. “14”. Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach (2nd ed.). USA: ASM Press. ISBN 1-55581-171-X.

7)Cimolai. MRSA and the environment: implications for comprehensive control measures. European journal of clinical microbiology & infectious diseases: official publication of the European Society of Clinical Microbiology (2008) vol. 27 (7) pp. 481-93

8)Curran JP, Al-Salihi FL (1980). “Neonatal staphylococcal scalded skin syndrome: massive outbreak due to an unusual phage type”. Pediatrics 66 (2): 285–90. PMID 6447271.

9)ulie Sevrens Lyons/Knight Ridder Newspapers, “A New Generation Faces Toxic Shock Syndrome,” The Seattle Times, January 25, 2005, http://seattletimes.nwsource.com/html/health/2002160362_healthtoxicshock26.html, accessed April 8, 2009, first published as “Lingering Risk,” San Jose Mercury News, December 13, 2004

10)Cenci-Goga BT, Karama M, Rossitto PV, Morgante RA, Cullor JS (September 2003). “Enterotoxin production by Staphylococcus aureus isolated from mastitic cows”. Journal of food protection 66 (9): 1693–6. PMID 14503727.

11)Patel AH, Nowlan P, Weavers ED, Foster T (December 1987). “Virulence of protein A-deficient and alpha-toxin-deficient mutants of Staphylococcus aureus isolated by allele replacement”. Infect. Immun. 55 (12): 3103–10. PMC 260034. PMID 3679545.

12)Chambers HF (2001). “The changing epidemiology of Staphylococcus aureus?”. Emerg Infect Dis 7 (2): 178–82. doi:10.3201/eid0702.010204. PMC 2631711. PMID 11294701.

13)Carter AP, Clemons WM, Brodersen DE, Morgan-Warren RJ, Wimberly BT, Ramakrishnan V (September 2000). “Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics”. Nature 407 (6802): 340–8. doi:10.1038/35030019. PMID 11014183.

14)Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover FC (1997). “Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility”. J Antimicrob Chemother 40 (1): 135–6. doi:10.1093/jac/40.1.135. PMID 9249217.

گردآورنده: زهرا پژنده