Northern blot

نوترون بلات : برای اندازه‌گیری مقدار RNA از یک ژن خاص استفاده کنید!

در ژنتیک مولکولی به عمل انتقال مولکول‌های تفکیک شده در الکتروفورز از ژل به روی یک

غشاء ویژه، بلاتینگ یا بلات کردن گفته می‌شود. معنای واژه انگلیسی بلاتینگ، لکه‌گذاری

است. اما سوال پیش اماده این است این تکنیک چگونه است؟ و کاربرد آن چیست؟

یا روشی موثر برای انواع رونویسی‌ها می‌باشد؟

ابتدا در نوترون بلات از ژل تغییر رنگ برای جدا کردن RNA با توجه به اندازه استفاده می‌شود.

سپس RNA به غشای نایلونی منتقل می‌شود در حالی که توزیع یکسانی در ژل نگهداری

می‌شود. مولکول RNA روی ژل تفکیک شده و به غشای سنتتیک برای اتصال پروب به آن

منتقل می‌شود و به پروب غیرمستقیم بسته شده و سپس شسته می‌شوند. غشای جامد

با پروب به طور خاص به RNA مورد نظر متصل می‌شود، سپس خشک شده و در معرض دید،

تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرد. از آنجا که نوترون بلات از جداسازی وابسته به اندازه استفاده

می‌کند، این تکنیک نه تنها می‌تواند فراوانی را بلکه اندازه رونویسی مورد نظر را نیز تعیین

کند. این روش می‌تواند بسیار موثر برای تشخیص انواع رونویسی ژن‌ها باشد.

با این حال، اگر مقدار RNA کل آزمایش محدود باشد و سطح بیان رونوشت خاص کم باشد،

می‌توان از تکنیک‌های حساس‌تر از نوترون بلات، مانند RT-PCR، استفاده کرد.

Northern blot

تکنیک نوترون بلات

تجهیزات:

منبع تغذیه
مایکروویو
سانتریفیوژ
دستگاه PCR
سد گرمایش
سیستم انتقال ژل خلاء
غشای نایلونی
پیوند عرضی UV
کوره هیبریداسیون
بطری‌های هیبریداسیون
اسپادکس G-50
لوله‌های پلی پروپیلن ۵/۱میلی‌لیتر
صفحه نمایش فسفر
تجهیزات اسکن صفحه فسفر
نرم‌افزار ImageQuant (دینامیک مولکولی)

Northern blot

نحوه عملکرد این تکنیک

مواد مورد استفاده در تکنیک نوترون بلات چیست؟

بخش مواد شامل دو بخش است:

بخش اول لیستی جامع از مواد شیمیایی و معرف‌های مورد نیاز برای آزمایش است. مثال:

Agarose
MOPS
Sodium acetate
NaOH
HCl
Formaldehyde
Glycerol
Ethidium bromide
Bromophenol blue
Xylene cyanol
Orange G
Formamide
Millennium RNA ladder (Ambion)
MgCl2
NTPs: ATP, CTP, GTP, UTP
[α-P32]-UTP
Salmon sperm DNA
NaCl
Sodium Citrate
Ficoll 400
Polyvinylpyrrolidone
Bovine Serum Albumin
SDS
Sodium heparin
NaH2PO4
Na2HPO4
Tris-HCl (pH 8.0)
DTT
Triton X-100
Spermidine, pH7.0
Taq buffer

محدودیت‌های‌ نوترون بلات :

۱.روش نوترون بلات در مقایسه با روش RT-PCR حسایت کم‌تری دارد.

۲. تکنیک نوترون بلات برخلاف تکنیک RT-PCR به چند نسخه از RNA نیازمند است.

۳. تکنیک نوترون بلات حتی نسبت به تخریب جزئی نمونه‌های RNA بسیار حساس است، تخریب به شدت بر کیفیت و کمیت داده‌ها تأثیر می‌گذارد.

۴. این تکنیک در مواردی که نیاز به افزودن چند پروب است، سخت می‌شود و فقط پس از برداشتن کامل پروب اول، می‌توان یک پروب دوم را به سیستم اضافه کرد. این می‌تواند روند

را بسیار پیچیده کند. پس از تصفیه سیستم با مواد شیمیایی سخت برای برداشتن اولین پروب، صحت داده‌های دورهای بعدی نیز ممکن است به خطر بیفتد.

۵. نوترون بلات فقط می‌تواند تجمع MRNAحالت پایدار را اندازه‌گیری کند و ثبات یا رونویسی RNA را نمی‌تواند اندازه گیری کند.

نتیجه‌گیری:

تکنیک نوترون بلات یک روش کلاسیک برای تجزیه و تحلیل حضور یک دنباله RNA خاص در

یک نمونه است. نوترون بلات نسبتاً تکنیکی ارزان و ساده است که در آزمایشگاه‌ها انجام

می‌شود. پیشرفت‌های اخیر در بافرها و غشاهای هیبریداسیون باعث ایجاد لکه‌هایی با

حساسیت بالا شده‌است. اما با این حال، پیشرفت‌های اخیر در فناوری PCR شناسایی

سریع، دقیق و ساده‌تررا و همچنین تعیین دقیق RNA را فعال کرده‌است.

منابع:

.ncbi Northern blot
Northern Blot / RNA Blot
/

زهرا موحدی‌نسب

Northern blot

 

0 پاسخ

دیدگاه خود را ثبت کنید

تمایل دارید در گفتگوها شرکت کنید؟
در گفتگو ها شرکت کنید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.