فهرست مطالب
در مطالب ارائه شدهی قبلی، به بررسی انواع محیطهای کشت های میکروبی و دستهبندی آنها پرداختهایم. در این مقاله، به بررسی یکی از مهمترین جنبههای دستهبندی این محیطها، یعنی دستهبندی از نظر کاربرد آزمایشگاهی میپردازیم؛ از این نظر، محیطهای کشت آزمایشگاهی در ۶ گروه دستهبندی میشوند:
- محیط کشت پایه
- محیط کشت غنی شده
- محیط کشت افتراقی
- محیط کشت انتخابی
- محیط کشت انتقالی
- محیط کشت اختصاصی
که در ادامه به بررسی هریک از این محیطها و کاربرد و انواع آنها خواهیم پرداخت.
1. انواع محیط کشت پایه
محیطهای کشت ساده، یکی از سادهترین انواع محیط کشت هستند که بهطور معمول حاوی یک منبع کربن، انرژی (منبع نیتروژن)، فاکتورهای رشد و مقدار کمی عناصر مختلف هستند و امکان رشد بسیاری از میکروارگانیسمهایی که نیازهای غذایی ویژه ندارند را فراهم میکنند. محیطهای پایه، تحت عنوان basal media یا basic media و نیز general-purpose media شناخته میشوند و از محیطهای غیر انتخابی به شمار میروند.
محیطهای کشت پایه، برای رشد استافیلوکوکوسها و انتروباکتریاسه مناسباند. این محیطها معمولا برای جداسازی میکروارگانیسمها در آزمایشگاهی، تهیهی محیطهای غنی شده و انجام subculture از باکتریهای پاتوژن کشت شده روی محیطهای انتخابی و افتراقی استفاده میشوند.
ازجمله مثالهای این نوع محیط کشت میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
1.1 نوترینت آگار
این محیط کشت جامد، یک محیط کشت ساده حاوی 3/0 درصد عصاره گوشت یا عصاره مخمر، 0.5 درصد پپتون، 5/0 درصد سدیمکلرید، 5 درصد آگار و نیز فاکتورهای رشد میباشد. این محیط کشت برای میکروارگانیسمهایی که احتیاج به شرایط خاص دارند مطلوب نیست اما رشد رنج وسیعی از باکتریهای غیر سخت رشد و نیز قارچها را حمایت میکند.
1.2 نوترینت براث
این محیط کشت مایع جهت مصارف عمومی برای میکروارگانیسمهایی که نیازهای رشد ویژه ندارند، استفاده میشود. محیط کشت مذکور از نظر ترکیبات مشابه محیط نوترینت آگار بوده، با این تفاوت که مادهی آگار که باعث ایجاد حالت جامد در محیط کشت میشود، در محیط نوترینت براث حذف شدهاست.
1.3 پپتون واتر
این محیط کشت مایع و غیر انتخابی بوده و از پپتات هضم شدهی بافتهای حیوانی و سدیمکلرید تشکیل شده است. پپتون واتر برای رشد بسیاری از باکتریها ازجمله کرونوباکتر، انتروباکتریاسه، اشریشیا کلای و سالمونلا در نمونههای غذایی و آب مناسب است. این محیط میتواند بهعنوان محیط پایه برای ساخت محیطهای غنی شده و نیز محیطهای تخمیر کربوهیدرات بهکار گرفته شود.
2. انوع محیط کشت غنی شده
دومین نوع از انواع محیط کشت، محیطهای غنی شده هستند که با اضافه کردن موادی مثل خون، سرم و یا زردهی تخم مرغ به محیطهای پایه، بدست میآیند. این محیطها برای کشت دادن میکروارگانیسمهای سخت رشد (fastidious microorganisms) که به مواد مغذی و فاکتورهای رشد بیشتری نیاز دارند، بهکار میروند. بلاد آگار، شکلات آگار و Loeffler’s serum slope، محیطهای کشتی هستند که در این دسته جای میگیرند؛ در ادامه به بررسی هر یک از این محیطها میپردازیم:
2.1 بلاد آگار
محیط کشت عمومی که به منظور تکثیر و جداسازی باکتریهای بیماریزا، به ویژه باکتریهایی که برای رشد به مواد مغذی بیشتری نیاز دارند و سخت رشد هستند، بهکار میرود. نحوهی تهیهی این محیط، به این صورت است که پس از اتوکلاو کردن محیط پایه، هنگامی که دمای آن به حدود 50 درجه سانتیگراد رسیده، خون دفیبرینه گاو را به میزان 5 تا 7 درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیتهای استریل میریزیم. بهعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتریها را میتوان کاوش کرد که ایجاد سه حالت محتمل است:
– همولیز کامل یا همولیز بتا: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده و اطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد میگردد که نشان دهندهی لیز شدن کامل گلبولهای خون موجود در محیط کشت است.
– همولیز ناقص یا همولیز آلفا: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از ۵۰ درصد میباشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد میگردد.
-عدم همولیز یا همولیز گاما: باکتری فاقد آنزیم همولیزین میباشد.
2.2 شکلات آگار
اجزای تشکیل دهندهی این محیط و روش تهیهی آن کاملا مشابه با محیط بلاد آگار است، با این تفاوت که بعد از اتوکلاو کردن محیط، زمانی که دمای آن در حدود 70 تا 80 درجه سانتیگراد است، خون دفیبرینه را در شرایط استریل به محیط پایه اضافه میکنیم. این محیط، میتواند رشد باکتریهایی مثل نایسریاها و هموفیلوس که باکتریهایی سختگیر بوده و برای رشد نیاز به مواد مغذی بیشتری دارند را حمایت کند؛ این امر به این علت است که گلبولهای قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای موجود در آنها خارج میگردد و مواد مغذی بیشتری در دسترس باکتری قرار میگیرد. همانند محیط کشت اگار خوندار، دراین محیط نیز میتوان ایجاد همولیز توسط باکتری را بررسی کرد.
2.3 محیط Loeffler’s serum slope
این محیط به صورت شیبدار بوده و برای جداسازی اولیه و ثانویه و نیز تلقیح میکروارگانیسمهای پاتوژن سخت رشد مثل کورینه باکتریوم دیفتریا، به ویژه انواع جدا شده از ناحیهی حلق و بینی کاربرد دارد. این محیط همچنین قادر به بازیابی فاکتورهای بیماریزایی و سایر ویژگیهای تشخیصی باکتریها، حتی در صورتی که از بین رفته باشند، میباشد؛ این ویژگی بازیابی به علت انکوباسیون طولانی مدت و انجام subculture مکرر میباشد. این محیط حاوی پپتیک هضم شده از بافت حیوانی (PDAT)، سرم گاوی، عصارهی عضلهی قلبی، ساختارهای پیچیدهی حاوی نیتروژن، دکستروز به عنوان منبع کربوهیدرات قابل تخمیر و نیز سدیم کلرید میباشد.
3. انواع محیط کشت افتراقی
سومین نوع از انواع محیط کشت، محیطهای کشت افتراقی هستند که با نامهای Differential media و یا indicator media نیز آنها را میشناسیم و حاوی معرفهای ویژهای مثل رنگها یا پیشمادههای متابولیک هستند که به کلنیهای گونههای مختلف باکتریایی، رنگهای متفاوتی میدهند. این معرفها شامل فنول رد، نوترال رد و متیلن بلو هستند که پس از انجام واکنش شیمیایی تغییر رنگ میدهند.
اما مهمترین انواع محیطهای افتراقی شامل موارد زیر میباشد:
3.1 بلاد آگار
همانطور که پیشتر اشاره شد، این محیط امکان بررسی نوع همولیز و تشخیص باکتری بر این اساس را امکانپذیر میکند. به عنوان مثال باکتری استرپتوکوک پیوژنز دارای همولیز بتا و استرپتوکوک پنومونیا دارای همولیز آلفا میباشد؛ درحالیکه میکروارگانیسمهایی همچون انتروکوکوس فکالیس، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، فاقد همولایزین هستند.
3.2 مانیتول سالت آگار
در این محیط، تخمیر قند مانیتول بررسی میشود. استافیلوکوکوس اورئوس، قادر به تخمیر مانیتول بوده و باعث زرد شدن رنگ محیط میشود؛ این درحالیست که استافیلوکوکسیهای کواگولاز منفی، قادر به تخمیر مانیتول نبوده و رنگ محیط صورتی باقی میماند.
3.3 مککانکی آگار
برای تفریق باکتریهای گرم منفی، بر اساس متابولیسم لاکتوز آنها میباشد. رنگ محیط، در حالتی که باکتری روی آن تلقیح نشده باشد، به رنگ صورتی روشن است. باکتریهایی که قادر به تخمیر لاکتوز هستند، مثل اشریشیا کلای، زیر گونههای کلبسیلا، سیتروباکتر و انتروباکتر، روی این محیط کلنیهای صورتی تا ارغوانی تولید میکنند؛ باکتریهای غیر تخمیر کنندهی لاکتوز، مثل سالمونلا، شیگلا، پروتئوس، پرویدنشیا، سودوموناس و مورگانلا، کلنیهای بدون رنگ روی محیط مککانکی تشکیل میدهند. محیط مککانکی آگار علاوه بر داشتن 1% قند لاکتوز، حاوی 1.7% پپتون، 0.3% پلیپپتون، 0.15% نمگهای صفراوی، کریستال ویوله، نوترال رد، 0.5% سدیمکلرید، 1.35% آگار و pH حدود 7.1 میباشد.
3.4 تیوسولفات سیترات بایل سالت سوکروز آگار (TCBS)
این محیط حاوی قند سوکروز بوده که باکتریهای مختلف براساس تخمیر یا عدم تخمیر این قند، کلنیهای با رنگ متفاوت روی محیط تشکیل میدهند. باکتری ویبریوکلرا قادر به تخمیر سوکروز بوده و کلنیهایی به رنگ زرد، با مرکز تیره و حاشیهی شفاف تولید میکند، درحالیکه باکتری ویبریو پاراهمولیتیکوس، قادر به تخمیر این قند نبوده و کلنیهایی به رنگ سبز تا سبز-آبی تولید میکند.
۴. انواع محیط کشت انتخابی
چهارمین نوع از انواع محیط کشت محیطهای انتخابی هستند؛ چنین محیطهایی به انواع خاصی از باکتریها اجازهی رشد میدهند و رشد باکتریهای دیگر را مهار میکنند. رشد انتخابی باکتریها روی این محیطها، از طریق افزودن موادی مثل آنتیبیوتیکها، رنگها، نمکهای صفراوی و یا تغییرات pH کنترل میشود. این محیطها حاوی آگار بوده و بهطور معمول برای جداسازی باکتریها در آزمایشگاه مورد استفاده قرار میگیرند. در ادامه، انواع محیطهای انتخابی و فاکتورهای مهارکنندهی موجود در آنها را بررسی میکنیم:
4.1 تایر مارتین آگار (Thayer Martin Agar)
حاوی آنتیبیوتیک ونکومایسین، کولسیتین و نایستاتین بوده و محیطی انتخابی برای باکتری نایسریا گنوره میباشد.
4.2 مککانکی آگار
همانطور که پیشتر ذکر شد، حاوی نمکهای صفراوی بوده و برای جداسازی اعضای خانوادهی انتروباکتریاسه به کار میرود.
4.3 محیط لُوِنشتاین جِنسِن (Lowenstein Jensen Medium)
حاوی مالاشیت گرین، گلیسرول، پودر سیبزمینی، تخممرغ کوآگوله شده و نمک بوده و برای جداسازی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کاربرد دارد. مالاشیتگرین موجود در این محیط، از رشد باکتریهای گرم مثبت جلوگیری میکند.
4.4 مانیتول سالت آگار
حاوی 10 درصد سدیمکلرید بوده و برای بازیابی استافیلوکوکوس اورئوس به صورت انتخابی عمل میکند.
4.5 کریستال ویولت بلاد آگار
حاوی 0.0002 درصد کریستال ویوله بوده و برای باکتری استرپتوکوکوس پیوژنز، یک محیط انتخابی بهشمار میرود.
4.6 تیوسولفات سیترات بایل سالت سوکروز آگار (TCBS)
این محیط pH در محدودهی قلیایی، حدود 8.6 – 8.5 دارد و برای جداسازی ویبریوکلرا به کار میرود.
4.7 محیط Wilson and Blair’s Agar
حاوی رنگ برلیانت گرین بوده و برای بازیابی سالمونلا تیفی بهکار میرود.
4.8 محیط پتاسیم تلوریت (Potassium tellurite medium)
حاوی 0.04 درصد پتاسیم تلوریت میباشد و برای بازیابی کورینه باکتریوم دیفتریا کاربرد دارد.
4.9 محیط cetrimide agar
حاوی یک عامل آنتیسپتیک به نام cetrimide بوده و برای احیای سودوموناس آئروژینوزا به کار میرود.
4.10 محیط سالمونلا- شیگلا آگار
حاوی 0.85% نمکهای صفراوی، برلیانت گرین، 0.85% سدیم سیترات،0.5% عصاره گوشت، 0.5% پپتون، 1% قند لاکتوز، 0.85% سدیم تیوسولفات، 0.1 % فریک سیترات، نوترال رد و 1.4% آگار بوده و برای جداسازی سالمونلا عامل تیفوئید بهکار میرود. PH این محیط در محدودهی7.4 میباشد و در حالتی که باکتری روی آن تلقیح نشده، به رنگ قرمز است.
نمکهای صفراوی، رنگ برلیانت گرین و سدیم سیترات موجود در محیط، مسئول مهار کردن رشد باکتریهای گرم مثبت و بسیاری از کلیفرمها هستند.
4.11 محیط برلیانت گرین آگار
محیطی است انتخابی و برای جداسازی گونههای سالمونلا بهکار میرود. این محیط از رشد بسیاری از باکتریهای رودهای (انتروباکتریاسه) بهجز سالمونلا جلوگیری مینماید؛ درصورت رشد باکتریهای لاکتوز مثبت، مثل E.coli، کلبسیلا، پروتئوس و سایر اعضای خانوادهی انتروباکتریاسه، معرف فنل رد موجود در این محیط به رنگ زرد در میآید؛ در حالیکه کلنیهای باکتریهای لاکتوز منفی همانند سالمونلا، به دلیل عدم تخمیر قند در مجاورت معرف، به رنگ ارغوانی در میآیند.
۵. انواع محیط کشت انتقالی
محیطهای انتقالی، پنجمین نوع از اونواع محیط کشت هستند که برای نمونههای کلینیکی که بلافاصله پس از نمونهبرداری امکان کشت آنها وجود ندارد و نیاز به انتقال سریع به آزمایشگاه دارند، مناسباند. این محیطها قادر به حفظ حیات پاتوژنهای بالقوه هوازی و بیهوازی و جلوگیری از رشد بیش از حد کومنسالها یا میکروارگانیسمهای آلودهکننده در نمونهی مورد نظر هستند. از نظر قوام، محیطهای انتقالی غالبا نیمهجامد هستند. سه مورد از انواع محیطهای کشت مورد استفاده برای انتقال نمونه در ادامه آورده شدهاست:
5.1 محیط Sach’s buffered glycerol saline
برای انتقال نمونهی مدفوع بیماران مشکوک به اسهال خونی با عامل باسیلی استفاده میشود.
5.2 محیط Cary Blair transport and Venkatraman Ramakrishnan media
برای انتقال نمونههای مدفوع گردآوری شده از بیماران مشکوک به وبا، از این محیط استفاده میشود.
5.3 محیط Pike’s medium
نمونهبرداری انجام شده از حلق و گلو که حاوی استرپتوکوکسیها هستند، در این محیطها منتقل میشوند.
۶. انواع محیط کشت اختصاصی (special media)
ششمین نوع از انواع محیط کشت محیطهای اختصاصی هستند. این محیطها برای رشد باکتریهای خاص مناسب بوده و از آنها برای ایزولهکردن نوع خاصی از باکتری در یک مخلوط میکربی استفاده میشود.
6.1 محیط s.s آگار یا محیط سالمونلا- شیگلا آگار
برای جدا کردن سالمونلا و شیگلا بهکار میرود.
6.2 محیط مانیتول سالت آگار
برای تشخیص گونه بیماریزای استافیلوکوکوس اورئوس کاربرد دارد.
6.3 محیط Buffered charcoal yeast extract agar یا BCYE
برای جداسازی لژیونلا و نوکاردیاها کاربرد دارد.
6.4 محیط Cystine-tellurite agar
برای کشت کورینه باکتریوم دیفتریا استفاده میشود.
6.5 محیط Lim broth
محیطی مایع برای جداسازی استرپتوکوکوس آگالاکتیه میباشد.
6.6 مککانکی سوربیتول آگار
برای سویهی Escherichia coli O157 بهکار میرود.
6.7 محیط Regan Lowe agar
برای جداسازی Bordetella pertussis به صورت اختصاصی کاربرد دارد.
6.8 محیط تیوسولفات سیترات بایل سالت سوکروز آگار (TCBS)
محیطی اختصاصی برای گونههای ویبریو میباشد.
7_ انواع محیط کشت انتخابی افتراقی
هفتمین و آخرین نوع از انواع محیط کشت، گروهی تحت عنوان محیطهای انتخابی-افتراقی یا Selective and Differential Media بوده که در ادامه به آنها اشاره خواهیم کرد.
- محیط مککانکی آگار
- محیط سالمونلا-شیگلا آگار
- محیط ائوزین متیلن بلو آگار (EMB Agar or Levine)
یک محیط انتخابی-افتراقی، به رنگ قرمز است که حاوی 1% پپتون، 0.5% قند لاکتوز، ائوزین y، متیلن بلو و آگار میباشد. ائوزین موجود در محیط، از رشد باکتریهای گرم مثبت جلوگیری میکند و برای باکتریهای گرم منفی به صورت انتخابی عمل میکند. بررسی تخمیر قند لاکتوز در محیط، به عنوان یک عامل افتراقی کمککننده است. لازم به ذکر است که باکتری اشریشیاکلای، قادر به ایجاد جلای سبز فلزی روی این محیط میباشد.
7.1 محیط هکتون انتریک آگار (HE)
یک محیط انتخابی-افتراقی برای جداسازی و کشت باکتریهای گرم منفی رودهای، به ویژه گونههای سالمونلا و شیگلای موجود در نمونههای مدفوع بهکار میرود. مواد تشکیلدهندهی این محیط شامل پرتئاز پپتون، سدیمکلرید، عصارهی مخمر، نمک صفراوی، سالیسین، لاکتوز، ساکاروز، برموتیمولبلو، فوشین اسیدی، آگار و Ammoniacal iron citrate میباشند. در حالتی که باکتری روی محیط تلقیح نشده، رنگ محیط سبز روشن است. باکتریهای فلور نرمال رودهای، محیط را به رنگ نارنجی درمیآورند، درحالیکه باکتری سالمونلا کلنیهای سبز روشن با مرکز سیاه و باکتری شیگلا نیز کلنیهای سبز رنگ روی محیط ایجاد میکند.
7.2 محیطXylose Lysine Deoxycholate Agar یا XLD agar
این محیط برای جداسازی سالمونلا و شیگلا از نمونههای رودهای کاربرد دارد و حاوی زایلوز، لایزین، لاکتوز، سوکروز، سدیم کلرید، فنول رد، سدیم تیوسولفات، فریک آمونیوم سولفات، سدیم دزوکسیکولات، عصارهی مخمر و آگار میباشد. سدیم دزوکسیکولات به مقدار کم در محیط وجود دارد که از رشد باکتریهای گرم مثبت جلوگیری و به عنوان عامل انتخابی عمل میکند.
نویسنده: ستاره سنگری
منبع1: کتاب میکروبشناسی مورای
2 نظرها