دسته‌بندی نشدهعلمی

وکتور کلونینگ؛ دستاورد جنجال آفرین در جهان علم!

وکتور کلونینگ، دستاورد جنجال آفرین جهان علم در سال‌های اخیر بوده است. نگرانی‌های اولیه پیرامون کلونینگ با آغاز تلاش دانشمندان برای شبیه‌سازی انسان جدی‌تر شده و موضع‌گیری دولت‌ها را در سراسر جهان به دنبال داشته است؛ اما در زمینه درمان، اکثر کشورها تحقیقات سلول‌های اجدادی را در چهارچوب پروتکل‌های نظارتی ویژه‌ای، مجاز دانسته‌اند.

دست‌ورزی‌های ژنتیکی، ابزاری قدرتمند در اختیار ژنتیک‌دانان قرار داده است تا مولکول‌های هدف را برای رسیدن به اهداف گوناگون ویرایش کرده و ویژگی‌های جدیدی را به آن‌ها اضافه کنند. لازمه گام برداشتن در این مسیر، مطالعات بیو انفورماتیکی قوی بوده که با کمک نرم افزار‌های مختلف قابل انجام است. در دهه 1970، ساخت اولین نسل از وکتور کلونینگ شروع شد و از آن زمان تاکنون، تعداد زیاد و متنوعی از وکتورهای کلونینگ تولیدشده، در دسترس قرارگرفته‌اند. بنابراین مهم‌ترین گام در فرایند کلونینگ، انتخاب یک وکتور کلونینگ مناسب است.

کلونینگ چیست؟

وکتور

وکتور، یک مولکول DNA (معمولا پلاسمید یا ویروس) است که به عنوان وسیله نقلیه برای حمل یک بخش DNA خاص به سلول میزبان به عنوان بخشی از تکنیک شبیه‌سازی (کلونینگ) یا DNA نوترکیب استفاده می‌شود.

یک وکتور حاوی DNA خارجی، DNA نوترکیب نامیده می‌شود. وکتور معمولا به تکثیر و یا بیان توالی DNA  وارد شده در داخل سلول میزبان کمک می‌کند. در شبیه‌سازی مولکولی، وکتور هر ذره‌ای است که به‌‌عنوان وسیله‌ای برای حمل مصنوعی یک توالی هسته‌ای خارجی (معمولا DNA) به سلول دیگر استفاده می‌شود؛ جایی که می‌توان آن را همانندسازی و یا بیان کرد.

با وجود در دسترس‌ بودن تعداد وکتورهای متنوع، برای انتخاب وکتور مناسب باید این موارد را در نظر گرفت:

  1. اندازه قطعه‌ای که قرار است به وکتور اضافه شود؛
  2. تعداد کپی‌ها؛
  3. ظرفیت وکتور؛
  4. تعداد نشانگرهای قابل انتخاب؛
  5. جایگاه‌های کلونینگ؛

6.در نظر گرفتن عملکرد وکتور.

نوعی از وکتور (پلاسمید)
نوعی از وکتور (پلاسمید)

کلونینگ

شبیه‌سازی به معنای ایجاد کپی یا کپی‌های دقیق است. شبیه‌سازی در بیوتکنولوژی به فرایند ایجاد کپی‌های یکسان از قطعات DNA، سلول‌ها و یا موجودات اشاره دارد. ارگانیسمی که ساختار ژنتیکی یکسان و ویژگی‌های مورفولوژیکی ارگانیسم مبدا را دارد، کلون نامیده می‌شود؛ در‌حالی‌که این فرایند، کلونینگ نام دارد.

اجزای وکتورهای کلونینگ

  1. یک مبداء همانند سازی
  2. ژن مارکر انتخابی (مثلا ژن‌های مقاوم به”AMP”)
  3. چندین سایت کلونینگ که محل برش به وسیله آنزیم‌های محدودالاثر هستند.

یک مولکول DNA برای آن که بتواند به عنوان یک وکتور کلونینگ عمل کند باید چند ویژگی داشته باشد. اولین و مهم‌ترین ویژگی، آن است که بتواند در سلول میزبان همانند‌سازی کند؛ بنابراین توسط آن، کپی‌های متعددی از مولکولDNA  نوترکیب ایجاد و به سلول‌های دختری منتقل می‌شود. یک وکتور کلونینگ باید نسبتا کوچک و اندازه آن کمتر از10 kb  باشد؛ زیرا مولکول‌های بزرگ در حین تخلیص شکسته می‌شوند و همچنین دستکاری و تغییردادن آن‌ها مشکل‌تر است. دو نوع مولکول DNA که این ویژگی‌ها را دارد، در سلول‌های باکتریایی یافت می‌شود؛ مانند کروموزوم‌های باکتریوفاژی و پلاسمیدی.

اگر چه پلاسمیدها غالبا به عنوان وکتورهای کلونینگ استفاده می‌شوند؛ اما دو نوع از تیپ‌های مهم وکتوری که امروزه کاربرد دارند، از باکتریوفاژها مشتق شده‌اند.

کلونینگ
کلونینگ

ویژگی وکتورهای کلونینگ

1. اندازه DNA قرارگرفته در وکتور

برای کلون‌کردن قطعات بزرگ DNA انواعی از وکتورها موجود هستند. این وکتورها برای ایجاد خزانه‌های DNA  استفاده می‌شوند. این وکتورها از مجموعه‌‌ای از وکتورهای نوترکیب تشکیل شده‌اند که طبق اصول کلون‌کردن به‌دست آمده‌اند. یک خزانه DNA از قطعات حاصل از برش ژنوم کامل یک موجود به وسیله آنزیم‌های اندونوکلئاز تشکیل شده است؛ کلونی‌های حاوی قطعات ژنتیکی جدا می‌شوند و از نظر وجود ژن‌های مورد نظر بررسی شده و کلونی حاوی ژن، انتخاب می‌شود.

2. تعداد رونوشت

وکتورهای کلونینگ مختلف بسته به واحد همانند‌سازی (رپلیکون) پلاسمید، تعداد کپی‌های متفاوتی دارند. پلاسمیدهای با منشاء “Col E1″، 20- 15 کپی دارند اما یک رپلیکون “Col E1” جهش‌یافته همانند پلاسمیدهای سری “pUC”، 700-500 کپی دارد. این کپی‌ها در نتیجه یک موتاسیون نقطه‌ای در مولکول تنظیمی” RNA ІІ” ایجاد می‌شوند که آن را نسبت به مهار یا “RNAІ” مقاوم‌تر می‌کند. همچنین این جهش باعث حساسیت به دما می‌شود؛ به طوری که “RNA ІІ” جهش یافته نسبت به مهار با” RNA І” در دمای ˚37 و ˚42 مقاوم است اما در˚30 مقاوم نیست.

در این دما کپی پلاسمیدهای “Col E1” غیرجهش‌یافته باز می‌شوند. در بعضی موارد یک کپی بالا ممکن است برای کلونینگ DNA مشکل ایجاد کند. برای مثال، DNA کلون‌شده، ممکن است پروتئین‌هایی را کد کند که در مقادیر بالا برای سلول توکسیک باشند، حتی اگر پروتئینی از DNA کلون‌شده در سطح پایینی بیان شود، وجود کپی‌های زیاد از ژن داخل پلاسمید ممکن است سطح پروتئین را تا حد سمیت بالا ببرد که در این موارد استفاده از پلاسمیدهایی با تعداد کپی پایین‌تر می‌تواند سطح پروتئین را تا زیر حد سمیت کاهش دهد. برای مثال “pBR322”  دارای رپلیکون “Col E1” هستند و بنابراین 20 – 15 رونوشت دارند. پلاسمیدهای سری “PACY” دارای رپلیکون “P15A” هستند که 22 – 18 رونوشت دارد. پلاسمیدهایی با رونوشت پایین شامل  “pSC101″و” BACS”، به ترتیب 5 و 1 رونوشت دارند.

3. ناسازگاری

اگر دو یا چند نوع از پلاسمیدها نتوانند با هم در یک سلول میزبان وجود داشته باشند، گفته می‌شود که آنها به یک گروه ناسازگاری تعلق دارند. پلاسمیدهایی از گروه‌های ناسازگاری متفاوت می‌توانند با هم در یک سلول حفظ شوند. این اتفاق زمانی رخ می‌دهد که دو پلاسمید مختلف، حداقل از یک جز عملکردی مشترک برای همانند‌سازی و پارتیشن‌بندی جهت تقسیم سلولی استفاده کنند.

بنابراین رقابت برای استفاده از اجزای عملکردی مشترک در سلول به‌ وجود می‌آید و طبق مکانیسم انتخاب طبیعی، پلاسمید غالب در سلول باقی‌مانده و پلاسمید دیگر حذف می‌شود. سایز پلاسمید نیز در حفظ آن در روند کشت اثر می‌گذارد؛ به‌طوری‌که پلاسمیدهای بزرگ‌تر زمان طولانی‌تری برای همانندسازی نیاز دارند و توسط پلاسمیدهای کوچکتر که سریع‌تر همانند‌سازی می‌کنند از سلول حذف می‌شوند.

4. مارکر انتخابی

وارد‌کردن پلاسمیدها به سلول‌های E.coli فرایند کارآمدی نیست؛ زیرا بسیاری از کلونی‌های حاصل، فاقد مولکول پلاسمید بوده و تمیزدادن آنها از کلونی‌های دارای پلاسمید کاری بسیار دشوار است. به علاوه سلول‌های فاقد پلاسمید نسبت به سلول‌های دارای پلاسمید رشد بهتری دارند و به ‌علت همانندسازی همزمان DNA کروموزومی و پلاسمید وارد‌شده در سلول‌های دارای پلاسمید، این سلول‌ها انرژی بیشتری را صرف تکثیر کرده‌اند و مسلما رشد کمتری خواهند داشت؛ به‌خصوص زمانی که پلاسمیدهای بزرگ و یا پلاسمیدهایی با تعداد رونوشت بالا در سلول وارد شده باشد. بنابراین روشی برای انتخاب کلونی‌های دارای‌ پلاسمید، مورد نیاز است. این امکان همیشه با حضور یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در پلاسمید، فراهم می‌شود.

اضافه‌کردن آنتی بیوتیک به محیط کشت موجب می‌شود، تنها سلول‌هایی که ژن مقاوم به آنتی بیوتیک مربوطه را به دلیل حضور یک پلاسمید نوترکیب بیان می‌کنند، زنده بمانند و رشد کنند و سلول‌های فاقد پلاسمید حذف شوند. در این مورد، فقط بعضی آنتی بیوتیک‌ها برای استفاده مناسب هستند؛ زیرا بعضی از آنتی بیوتیک‌ها مصارف درمانی دارند و استفاده از ژن مقاومت به این آنتی بیوتیک‌ها در پلاسمیدها جهت کلونیگ صحیح نیست.

بعضی سویه‌های E.coli مقاومت ذاتی به بعضی از آنتی بیوتیک‌ها دارند؛ بنابراین از ژن مقاوم به آن آنتی بیوتیک جهت غربالگری سلول‌های ترانسفورم شده طی پروسه کلونینگ، نمی‌توان استفاده کرد و باید ژنوتیپ سویه‌های مورد استفاده، قبل از پروسه کلونینگ بررسی شود.

قراردادن ژن مقاومت به آنتی بیوتیک‌ها به عنوان مارکر انتخابی در وکتورها در مکان‌های پایین دست پروموتر مناسب نیست؛ برای مثال قطع‌شدن ژن هدف هنگام قراردادن یک کاست مقاومت آنتی بیوتیکی موجب موتاسیون ژن کلون‌شده می‌شود و مقاومت آنتی بیوتیکی حاصل شده از ورود کاست، به عنوان مارکری جهت شناسایی DNA جهش یافته استفاده می‌شود.

وکتورهای مقاوم به آنتی بیوتیک

در مورد وکتورهایی که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در پایین دست پروموتر تعبیه‌شده دارند، در صورت کلون‌شدن ژن در داخل وکتور، پلاسمید نوترکیب ایجادشده توانایی انتقال مقاومت آنتی بیوتیکی به سلول‌های ترانسفورم شده را نخواهد داشت.

بسیاری ازجایگاه‌های کلونینگ (محل اثر آنزیم‌های محدودالاثر) در داخل ژن مقاومت آنتی بیوتیکی قرار دارند و هنگامی که DNA هدف با ورود خود ناحیه کد‌کننده ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را قطع کند، ژن مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک مربوطه بیان نخواهد شد؛ به این غیرفعال‌شدن در اثر ورود ژن خارجی، غیرفعال‌شدن تداخلی” Insertional Inactivation” می‌گویند. از غیرفعال‌شدن تداخلی برای بررسی ورود یا عدم ورود ژن مورد نظر به داخل پلاسمید استفاده می‌شود.

وکتورهای جدید، جایگاه‌های کلونینگ ویژه‌ای را دارند تا در هنگام کلونینگ DNA هدف، عملکرد وکتور مختل نشود. بعضی وکتورهای پلاسمیدی دو شاخص مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک را دارند؛ برای مثال پلاسمید “pBR322″، هم مقاومت آمپی‌سیلینی و هم تتراسایکلینی دارد که باعث جداسازی راحت کلونی‌های حاوی این پلاسمید می‌شود.

مقاومت آنتی‌بیوتیکی متداول که در وکتورهای پلاسمیدی E. Coli تعبیه می‌شوند، عبارتند از: مقاومت به آمپی‌سیلین، کانامایسین، تتراسایکلین و کلرامفنیکل.

5. سایت‌های کلونینگ چندتایی MCS

کلونینگ DNA داخل یک وکتور شامل اتصال قطعه‌ای از DNA هدف به DNA وکتور است. این روند به وسیله قطعات DNA‌ ای که انتهای چسبناک دارند، انجام می‌شود؛ بنابراین وکتور انتخابی باید دارای جایگاه اثر آنزیم محدود‌کننده‌ای باشد که قطعه DNA هدف توسط همان آنزیم محدود‌کننده ایجاد شده باشد. قطعات  DNAبا انتهای صاف می‌توانند به یکدیگر متصل شوند. همین‌طور آنزیم‌های محدودکننده‌ای وجود دارند که بعد از برشDNA ، یک نوکلئوتید تنها درانتهای ۳′ ایجاد می‌کنند که اصطلاحا به آن انتهای برجسته می‌گویند.

انتهای برجسته با برش نوکلئوتید اضافی می‌تواند تبدیل به انتهای صاف شود. در بسیاری از وکتورهای قدیمی، جایگاه‌های اثر اندونوکلئازهای محدودکننده در پلاسمید پراکنده‌اند و اغلب در میان یکی از ژن‌های وکتور وجود دارند؛ برای مثال بسیاری از جایگاه‌های کلونینگ در وکتورهای “PACYC” در داخل یکی از ژن‌های کد‌کننده مقاومت آنتی‌بیوتیکی این پلاسمیدها قرار گرفته‌اند. کلون‌کردن در این جایگاه‌ها ژن مقاومت آنتی بیوتیکی را غیرفعال می‌کند و حساسیت بعدی به آنتی بیوتیک به عنوان غربالی برای پلاسمیدهای نوترکیب استفاده می‌شود.

مشخصه‌های وکتور کلونینگ
مشخصه‌های وکتور کلونینگ

انواع وکتورهای کلونینگ

1. پلاسمید Plasmid vector

پلاسمیدها، مولکول‌های DNA حلقوی خارج کروموزومی کوچکی هستند که قادر به تکثیر مستقل در سلول میزبان هستند. اینها اولین وکتورهایی بودند که در شبیه‌سازی ژن، مورد استفاده قرار گرفتند. در باکتری‌ها، یوکاریوت‌ها و باستانی‌ها یافت می‌شوند. پلاسمید‌ها، مولکول‌های DNA طبیعی خارج کروموزومی و خودتکثیر‌شونده هستند، تعداد کپی بالایی دارند و دارای ژن‌های مقاوم به آنتی بیوتیک هستند.

آنها پروتئین‌هایی را رمزگذاری می‌کنند که برای تکثیر خودشان ضروری هستند. مهمترین ویژگی پلاسمیدها که آنها را به یکی از بهترین ناقل‌ها تبدیل می‌کند، اندازه کوچک آنها است. اندازه کوچک پلاسمید، جداسازی DNA نوترکیب از DNA  ژنومی میزبان را تسهیل می‌کند.

پلاسمید
پلاسمید

2.کاسمید Cosmid

ناقل‌های کیهانی، ناقل‌های ترکیبی هستند که از ناقل‌های پلاسمید و فاژ λ تشکیل شده‌اند که می‌توانند تا 42 کیلوبایت DNA را در خود جای دهند. وکتورهای کاسمید با قرار دادن ناحیه” cos” ناقل فاژ در وکتورهای پلاسمید تهیه می‌شوند.

وکتورهای کیهانی به منظور ترکیب مولکول‌های DNA با اندازه بزرگ که توسط پلاسمیدها قابل حمل نیستند، ایجاد می‌شوند.

از آنجایی که این ناقل‌ها هیبریدی هستند، می‌توانند مانند پلاسمیدها در داخل سلول میزبان تکثیر شوند یا مانند فاژ بسته‌بندی شوند.

کاسمید
کاسمید

3.باکتریوفاژ Bacteriophage vector

ناقل‌های باکتریوفاژ، ویروس‌هایی هستند که فقط باکتری‌ها را آلوده می‌کنند.

باکتریوفاژها (فاژها) بازده تبدیل بالاتری دارند که شانس بازیابی یک کلون حاوی بخش‌های DNA نوترکیب را افزایش می‌دهد. مهمترین ویژگی یک فاژ، سیستم بسته‌بندی است که امکان ترکیب ژن‌های یوکاریوتی بزرگ و عناصر تنظیم‌کننده آنها را فراهم می‌کند. استفاده از فاژها همچنین جداسازی مقادیر بیشتری از DNA را که می‌تواند برای تجزیه و تحلیل مورد استفاده قرار گیرد، تسهیل می‌کند.

باکتریوفاژ
باکتریوفاژ

4. کروموزوم مصنوعی باکتریایی Bacterial artificial chromosome

کروموزوم‌های مصنوعی باکتریایی، مولکول‌های DNA مهندسی‌شده‌ای هستند که برای شبیه‌سازی بخش‌های DNA در سلول‌های باکتری (معمولا E. coli) استفاده می‌شوند.

اینها از یک منشا تکثیر فاکتور “F” مشتق از باکتری تشکیل شده‌اندکه انتشار قطعات بزرگ DNA را به شکل دایره‌ای ابرپیچ ممکن می‌سازد.

کروموزوم‌های مصنوعی باکتریایی می‌توانند اندازه بسیار بزرگتری از DNA وارد‌شده را در مقایسه با ناقل‌های پلاسمید یا فاژ حمل کنند.

کروموزوم مصنوعی باکتریایی
کروموزوم مصنوعی باکتریایی

5. کروموزوم مصنوعی مخمر Yeast artificial chromosome

کروموزوم‌های مصنوعی مخمر، مولکول‌های DNA مهندسی شده‌ای هستند که برای شبیه‌سازی  DNAوارد شده در سلول‌های مخمر، به ویژه “Saccharomyces cerevisiae” استفاده می‌شوند.

این نوع کروموزوم‌ها به منظور شبیه‌سازی توالی‌های بزرگی از DNA به منظور افزایش کارایی فرایند، توسعه یافته‌اند.

آنها می‌توانند تا 500 کیلوبایت DNA را شبیه‌سازی کنند که بسیار بالاتر از اکثر وکتورهای شبیه‌سازی سنتی است؛ حتی اگر اینها اغلب به عنوان وکتور‌های کلونینگ استفاده شوند، در سایر فرایندهای ژنتیکی مانند توالی‌یابی و تجزیه و تحلیل DNA نیز مفید هستند. کروموزوم‌های مصنوعی مخمر مختلفی در طول سال‌ها ایجاد شده‌اند که برای اهداف مختلف استفاده می‌شوند. یکی از رایج‌ترین نمونه‌های مورد استفاده کروموزوم‌های مصنوعی مخمر، شامل pYAC4 است که به طور گسترده به عنوان یک وکتور کلونینگ استفاده شده است.

کروموزوم مصنوعی مخمر
کروموزوم مصنوعی مخمر

6.کروموزوم مصنوعی انسان Human artificial chromosome

کروموزوم‌های مصنوعی انسان، قطعات DNA خارج کروموزومی هستند که به عنوان یک کروموزوم جدید در سلول انسان عمل می‌کنند.

استفاده از کروموزوم‌های مصنوعی انسان با پیشرفت در مهندسی ژنتیک، افزایش یافته است؛ زیرا به غلبه بر مشکلاتی که معمولا با سیستم‌های وکتور سنتی مرتبط است، کمک می‌کند.

این کروموزوم‌ها می‌توانند به عنوان اپیزوم‌های تک نسخه‌ای بدون ادغام در کروموزوم‌های میزبان وجود داشته باشند که امکان نگهداری پایدار طولانی‌مدت را فراهم می‌کنند.

علاوه بر این، هیچ محدودیت بالایی در اندازه DNA ورودی برای گنجاندن در یک کروموزوم وجود ندارد؛ زیرا کل واحدهای ژنومی می‌توانند برای تقلید از بیان ژن طبیعی استفاده شوند. علی‌رغم مزایای متعدد، آنها فقط برای مطالعات مربوط به ساختار و عملکرد کینه توکورهای انسانی مورد استفاده قرار گرفته‌اند.

محدودیت‌های مرتبط با این نوع کروموزوم‌ها، به دلیل مشکلات فنی در طول بارگذاری ژن و ساختارهای نادرست وکتور‌ها است.

کروموزوم مصنوعی انسان
کروموزوم مصنوعی انسان

7. ناقلان ویروسی، حیوانی و گیاهی Animal and plant viral vectors

ویروس‌هایی که سلول‌های گیاهی و حیوانی را آلوده می‌کنند، دستکاری شده‌اند تا ژن‌های خارجی را به سلول‌های گیاهی و حیوانی وارد کنند. توانایی طبیعی ویروس‌ها برای جذب به سلول‌ها، معرفی DNA و تکثیر، آن‌ها را به وسیله‌ای ایده‌آل برای انتقال DNA خارجی به سلول‌های یوکاریوتی در کشت تبدیل کرده است.

در اولین آزمایش شبیه‌سازی سلول‌های پستانداران، از یک وکتور مبتنی بر ویروس سیمیان “40 (SV40)” استفاده شد. تعدادی ناقل بر اساس انواع دیگر ویروس‌ها مانند آدنوویروس‌ها و ویروس پاپیلوما برای شبیه‌سازی ژن‌ها در پستانداران استفاده شده است.

در حال حاضر، ناقل‌های رتروویروسی برای شبیه‌سازی ژن‌ها در سلول‌های پستانداران محبوب هستند. در مورد گیاهانی مانند ویروس موزاییک گل کلم، ویروس موزاییک توتون و ویروس جمینیا با موفقیت محدودی مورد استفاده قرار گرفته‌اند.

ناقلان ویروسی، حیوانی و گیاهی
ناقلان ویروسی، حیوانی و گیاهی

کلونینگ مولکولی

همسانه‌سازی مولکولی یا کلونینگ مولکولی اصطلاحی است که به‌طور عام به معنای جداکردن یک توالی از ژنوم یک موجود و قراردادن آن در ژنوم یا مولکول DNA موجود دیگر است. برای همسانه‌سازی مولکولی در آزمایشگاه، ابتدا ساختار دو پلاسمید را با استفاده از آنزیم‌های محدود‌کننده می‌شکنند و با استفاده از آنزیم “4T” لیگاز، تکه‌های آن دو را به هم متصل می‌کنند و سپس وارد یاخته‌ها می‌کنند؛ این تکنیک به همراه تکنیک PCR به‌طور مستقیم برای کپی‌کردن قسمتی از توالی  DNAمورد نظر استفاده می‌شود.

دو تفاوت بنیادی بین این روش‌ها وجود دارد. در همسانه‌سازی مولکولی، تکثیر DNA در داخل سلول زنده اتفاق می‌افتد؛ در‌حالی‌که در PCR، تکثیر DNA در داخل لوله آزمایش انجام می‌شود.

تفاوت دیگر این است که در همسانه‌سازی، قطعه مورد نظر از جایی بریده شده و به جای دیگری متصل می‌شود؛ درحالی‌که درPCR ، از روی یک توالی خاص کپی تهیه شده و تکثیر می‌شود. هدف‌های متنوعی از انجام کلون‌سازی دنبال می‌شود؛ برای مثال کلون‌سازی ژن در مواردی همچون تکثیر یک قطعه DNA، شناسایی و نقشه برداری ژن‌ها، تعیین توالی، جداسازی و بررسی پروموترها (آغازگرهای رونویسی ژن) و دیگر توالی‌های تنظیمی، تولید پروتئین‌های نوترکیب، ژن درمانی، ایجاد موجودات تراریخته، تهیه واکسن و ایجاد کیت‌های تشخیص طبی کاربرد دارد.

آنزیم محدودکننده

این آنزیم‌ها، مولکول DNA را در توالی نوکلئوتیدی خاصی قطع می‌کنند؛ به این توالی نوکلئوتیدی، جایگاه محدودکننده می‌گویند. گروهی از آنزیم‌های محدودکننده می‌توانند انتهای چسبنده در انتهای قطعهDNA  ایجاد کنند و این ویژگی آنزیم‌ها برای کلون‌کردن ژن درون پلاسمید استفاده می‌شود.

آنزیم لیگاز

لیگازها آنزیم‌‌هایی هستند که با ایجاد یک پیوند شیمیایی جدید قادر به اتصال به دو مولکول بزرگ هستند. به‌طور کلی با هیدورلیز همزمان یک گروه شیمیایی کوچک بر روی یکی از مولکول‌های بزرگ یا به سادگی پیوند دو ترکیب با یکدیگر (به‌عنوان مثال، آنزیم‌هایی که اتصال  C_N، C_S،C_O  و…) را کاتالیز می‌کنند.

وکتور‌های جدید

بیشتر وکتورهای جدید دارای یک رشته مصنوعی از DNA هستند که این رشته دارای تعداد زیادی سایت برش آنزیمی است و این جایگاه‌ها در هیچ جای دیگر پلاسمید وجود ندارد. این جایگاه‌های کلونینگ چندتایی یا پلی‌لینکرها، انتخاب وسیعی از آنزیم‌های اندونوکلئاز را برای استفاده در مرحله کلونینگ امکان‌پذیر می‌سازند و همچنین سایت کلونینگ را به یک ناحیه‌ی کوچک از وکتور محدود می‌کنند؛ برای مثال “MCS” های بسیاری از وکتورها مثل “pUC”، به وسیله توالی‌هایی که مکمل یکسری پرایمرهای عمومی مثل پرایمر “forward” و “reverse” متعلق به فاژ “M13” است، احاطه شده‌اند.

این جایگاه‌های “priming” به گونه‌ای هستند که امتداد پرایمرها را به این سایت‌ها متصل می‌کنند و اجازه تعیین توالی هر دو انتهای یک DNA هدف را در “MCS” می‌دهند؛ بدین ترتیب می‌توان یکسری از پرایمرهای عمومی را برای تعیین توالی DNA هدف بدون در نظر گرفتن این که در کدام جایگاه از “MCS” کلون شده‌اند، به‌کار برد.

“MCS” های بسیاری از پلاسمیدها با توالی کد‌کننده “lacZ” هم‌پوشانی دارند. در صورت کلون‌شدن ژن هدف در جایگاه کلونینگ این گونه پلاسمیدها، ژن “lacZ” غیرفعال شده و با استفاده از غربالگری سفید–آبی می‌توان سلول‌های حاوی پلاسمید نوترکیب را تمیز داد.

نویسنده: حدیث پرهیزگاری

ویراستار: سارا تاجداری

منابع:

  1. https://www.genome.gov/genetics-glossary/Vector#:~:text=A%20vector%2C%20as%20related%20to%20molecular%20biology%2C%20is,the%20inserted%20DNA%20sequence%20inside%20the%20host%20cell
  2. https://www.embibe.com/exams/cloning/#:~:text=What%20is%20Cloning%20in%20Biology%3F%20Cloning%20simply%20means,copies%20of%20either%20DNA%20fragments%2C%20cells%20or%20organisms
  3. https://byjus.com/biology/cloning-vector/#:~:text=A%20cloning%20vector%20should%20possess%20an%20origin%20of,gene%20that%20facilitates%20screening%20of%20the%20recombinant%20organism
  4. https://microbenotes.com/vector-molecular-biology/#:~:text=A%20vector%20is%20a%20substance%2C%20usually%20a%20piece,for%20different%20purposes%20like%20multiplying%2C%20expressing%2C%20or%20isolation
  5. https://link.springer.com/protocol/10.1385/1-59259-409-3:19
  6. https://biotechnews.blogsky.com/1393/07/07/post-291/
  7. https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/ligase
  8. http://shefayekhatam.ir/browse.php?a_id=1359&sid=1&slc_lang=fa
  9. http://biotechr.blogfa.com/post/13

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا