فهرست مطالب
ساترن بلات (southern blotting)
ساترن بلات یک روش آزمایشگاهی است که برای تشخیص توالی DNA خاص در نمونه خون یا بافت استفاده می‌شود. ساترن بلات یک روش آزمایشگاهی است که برای تشخیص مولکول‌های DNA خاص از بین بسیاری از مولکول‌های DNA دیگر استفاده می‌شود. این تکنیک از نام مخترع آن، ادوارد ساترن، گرفته شده‌است. به عنوان یک روش آزمایشگاهی، از لکه‌های ساترن بلات می‌توان برای تجزیه‌وتحلیل کل DNA یک موجود زنده، که به عنوان ژنوم آن نیز شناخته می‌شود، استفاده کرد تا توالی خاص مورد نظر را شناسایی کند. اولین قدم در لکه‌گیری ساترن بلات تهیه مخلوط DNA با تجزیه آن به قطعات کوچک با استفاده از پروتئینی به نام آنزیم محدودکننده است.
سپس مخلوط قطعات DNA با توجه¬به اندازه با استفاده از تکنیکی به نام الکتروفورز ژل جدا می‌شود. پس از جداسازی، قطعات دو رشته‌ای DNA در ژل تغییر شکل داده یا جدا می‌شوند. سپس، DNA از ژل به غشای لکه‌دار منتقل می‌شود. اگرچه این مرحله همان چیزی است که به این تکنیک «لکه‌گیری ساترن» می‌دهد، اما این اصطلاح معمولا برای توصیف کل روش استفاده می‌شود.
پس از اتمام انتقال، غشا همه نوارهای اصلی را روی ژل حمل می‌کند. سپس غشاء با قطعه کوچکی از DNA یا RNA به نام پروب درمان می‌شود که دارای توالی‌ای است که مکمل توالی DNA خاصی در نمونه است.
این اجازه می‌دهد تا کاوشگر به یک قطعه DNA خاص در غشا هیبرید شود یا متصل شود. علاوه¬بر این، کاوشگر دارای برچسب است که معمولا یک اتم رادیواکتیو یا یک رنگ فلورسنت است. بنابراین، پس از هیبریداسیون، کاوشگر اجازه می‌دهد تا قطعه DNA موردعلاقه را از بین بسیاری از قطعات مختلف DNA روی غشا تشخیص دهند.
روش انجام آزمایش
1. اندونوکلئازهای محدودکننده برای برش رشته‌های DNA با وزن مولکولی بالا به قطعات کوچکتر استفاده می‌شود.
2. سپس قطعات DNA بر روی ژل آگارز الکتروفورز می‌شوند تا اندازه آن‌ها جدا شود.
3. اگر برخی از قطعات DNA بزرگتر از 15 کیلوبایت باشند، قبل از لکه‌گیری، ژل ممکن است با اسیدی مانند HCl رقیق شده درمان شود. این باعث از بین‌رفتن قطعات DNA می‌شود و DNA را به قطعات کوچکتر می‌شکند و در نتیجه انتقال کارآمدتر از ژل به غشا امکان پذیر می‌شود.
4. اگر از روش‌های انتقال قلیایی استفاده می‌شود، ژل DNA را در محلول قلیایی(معمولاحاوی هیدروکسید سدیم) قرار می‌دهند تا DNA دو رشته‌ای را خنثی کند. تغییر رنگ در یک محیط قلیایی ممکن است اتصال بقایای تیمین با بار منفی DNA به یک گروه آمینوغشایی با بار مثبت را بهبود بخشد، و آن را به رشته‌های DNA منفرد برای هیبریداسیون بعدی به پروب و هر RNA باقی مانده‌ای را که ممکن است از بین برود، بهبود بخشد. هنوز در DNA وجود دارد با این حال، انتخاب روش‌های قلیایی نسبت به انتقال خنثی، اغلب تجربی است و ممکن است نتایج معادل داشته باشد.
5. ورقه‌ای از غشای نیتروسلولز(یا متناوباً نایلون)(یا بسته به جهت انتقال) زیر ژل قرار می‌گیرد. فشار به طور مساوی بر روی ژل اعمال می‌شود(یا با استفاده از مکش، یا با قراردادن یک دسته دستمال کاغذی و یک وزنه در بالای غشاء و ژل)، تا از تماس خوب و یکدست بین ژل و غشا اطمینان حاصل شود. در صورت انتقال با مکش، از بافر SSC 20X برای اطمینان از آب‌بندی و جلوگیری از خشک‌شدن ژل استفاده می‌شود. سپس بافر از طریق مویرگی از منطقه‌ای با پتانسیل بالای آب به منطقه‌ای با پتانسیل کم آب(معمولا کاغذ و کاغذهای فیلتر) را برای انتقال DNA از ژل به غشا استفاده می‌کند. برهمکنش های تبادل یونی به دلیل بار منفی DNA و بار مثبت غشا،DNA را به غشا متصل می‌کند.
6. سپس غشا در وکیوم یا فر معمولی در دمای 80 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 ساعت (در شرایط استاندارد؛ نیتروسلولز یا غشای نایلون) پخته می‌شود یا در معرض اشعه ماوراء بنفش (غشای نایلون) قرار می‌گیرد تا DNA منتقل‌شده به طور دائم به غشا متصل شود.
7. سپس غشاء در معرض یک پروب هیبریداسیون قرار می‌گیرد، یک قطعه DNA منفرد با توالی خاصی که باید در DNA هدف مشخص شود. برچسب DNA پروب به گونه‌ای است که می‌توان آن را تشخیص داد، معمولا با ترکیب رادیواکتیویته یا نشان‌دادن مولکول با رنگ فلورسنت یا کروموژنیک. در برخی موارد، پروب هیبریداسیون ممکن است از RNA ساخته شود تا DNA برای اطمینان از ویژگی اتصال پروب به DNA نمونه، در متدهای رایج هیبریداسیون از DNA اسپرم ماهی قزل آلا یا شاه ماهی برای مسدود کردن سطح غشا و DNA هدف، فرامید دیونیزه‌شده و موادشوینده مانند SDS برای کاهش اتصال غیر اختصاصی استفاده می‌شود.
8. پس از هیبریداسیون، پروب اضافی از غشا شسته می‌شود(معمولا با استفاده از بافر (SSC و الگوی هیبریداسیون در مورد اشعه ایکس با استفاده از اتورادیوگرافی در مورد یک پروب رادیواکتیو یا فلورسنت، یا در صورت ایجاد رنگ روی غشا تجسم می‌شود. از روش تشخیص کروموژنیک استفاده می‌شود.
نتیجه انجام روش ساترن بلات
هیبریداسیون پروب به یک قطعه DNA خاص در غشای فیلتر نشان می‌دهد که این قطعه حاوی توالی DNA است که مکمل پروب است. مرحله انتقال DNA از ژل الکتروفورز به غشا امکان اتصال آسان پروب هیبریداسیون برچسب خورده به DNA اندازه‌گیری شده را می‌دهد. همچنین امکان تثبیت هیبریدهای کاوشگر هدف، مورد نیاز برای تجزیه وتحلیل با استفاده از اتورادیوگرافی یا سایر روش‌های تشخیص را فراهم می‌کند. ممکن است از لکه‌های جنوبی با DNA ژنومی هضم شده با آنزیم برای تعیین تعداد توالی ها (به عنوان مثال، کپی ژن) در یک ژنوم استفاده شود. یک کاوشگر که فقط به یک قطعه DNA هیبرید می‌شود که توسط آنزیم محدودکننده بریده نشده¬است، یک باند واحد در یک لکه ایجاد می‌کند، در حالی که هنگامی که کاوشگر به چندین توالی بسیار شبیه هم هیبرید می‌شود، احتمالا چند نوار مشاهده خواهد شد. ممکن است نتیجه تکرار دنباله باشد.
اصلاح شرایط هیبریداسیون(به عنوان مثال، افزایش دمای هیبریداسیون یا کاهش غلظت نمک) ممکن است برای افزایش ویژگی و کاهش هیبریداسیون پروب به توالی هایی که کمتر از 100 similar مشابه هستند استفاده شوند.
نتیجه‌گیری
انتقال لکه‌های ساترن بلاتینگ ممکن است برای شبیه‌سازی براساس همولوژی براساس توالی اسید آمینه محصول پروتئینی ژن هدف استفاده شود. الیگونوکلئوتیدها طوری طراحی شده‌اند که شبیه توالی هدف هستند.
الیگونوکلئوتیدها به صورت شیمیایی سنتز، برچسب‌گذاری می‌شوند و برای غربالگری کتابخانه DNA یا مجموعه‌های دیگر از قطعات DNA شبیه‌سازی شده استفاده می‌شوند. دنباله‌هایی که با کاوشگر هیبریداسیون هیبرید می‌شوند، بیشتر تجزیه‌وتحلیل می‌شوند، به عنوان مثال، برای به دست آوردن توالی کامل ژن موردنظر. از لکه¬های ساترن بلات نیز می توان برای شناسایی محل‌های متیله‌شده در ژن‌های خاص استفاده کرد. نوکلئازهای محدودکننده MspI و HpaII، که هر دو در یک دنباله یکسان تشخیص داده می‌شوند و به¬طور خاص مفید هستند، بسیار مفید هستند. با این حال، HpaII مستلزم آن است که یک C در آن محل متیله شود، در حالی که MspI فقط DNA غیر متیل شده در آن محل را می‌شکند. بنابراین، هر محل متیله شده در یک توالی تجزیه‌وتحلیل شده با یک کاوشگر خاص توسط آنزیم اول، اما نه دومی، بریده می‌شود.
منابع:
- http://www.nature.com/wls/definition/southern-blot-289
- https://www.mybiosource.com/learn/southern-blotting/
- https://www.genome.gov/genetics-glossary/Southern-Blot
یک نظر