فهرست مطالب
ویرایش درمانی CRISPR-Cas9 با واسطه Rpe65 باعث بهبود فنوتیپ های بیماری در مدل موش از Amaurosis مادرزادی Leber شد
گردآورنده:
فروغ بازگیر- لیسانس زیست شناسی سلولی مولکولی-ژنتیک، دانشگاه آزاد اسلامی واحد بروجرد
چکیده
آموروز مادرزادی Leber (LCA)، یکی از دلایل اصلی نابینایی کودکی، در اثر جهش های مغلوب اتوزومال در چندین ژن شامل گروهی از اختلالات ناهمگن که شامل 24ژن بوده که این مجموعه در پاتوژنز نقش دارد. از جمله این ژنها میتوان به RPE65 اشاره نمود. این بیماری 5٪ str از کلیه دیستروفیهای شبکیه ارثی است. در این مطالعه، ما تصحیح درمانی CRISPR-Cas9 با واسطه جهش بی معنی مرتبط با بیماری در Rpe65 در موش rd12، یک مدل از LCA انسان انجام شده است. تزریق زیرشبکیه ای ویروس مرتبط با آدنو حامل CRISPR-Cas9 و DNA اهداکننده منجر به1٪ < ترمیم هومولوژی هدایت شده و 1.6٪ del حذف کدون توقف پاتوژن در Rpe65 در بافتهای اپیتلیال رنگدانه شبکیه موشهای rd12 شد. امواج a- و b الکترودینوگرامها تا 4/4 21 21.2٪ و 3.2٪ ± 3.2.8٪ از همتایان موش نوع وحشی خود را بر محرکهای روشن بعد از سازگاری تاریک 7 ماه پس از تزریق بازیابی کردند. هیچ مدرک مشخصی از اختلال بافت شناسی یا تومور زایی در طی 7 ماه مشاهده مشاهده نشده است. در مجموع، ما اولین اصلاح درمانی جهش بی معنی Rpe65 را با استفاده از CRISPR-Cas9 ارائه داده و بینش جدیدی را برای توسعه درمان های LCA بیان می کنیم.
کلیدواژه ها
Congenital Blindness,Leber,LBR
مقدمه
Amaurosis مادرزادی Leber (LCA) یک بیماری ارثی وابسته به شبکیه است که منجر به نابینایی کودکان می شود. در بین ژنهای ایجاد کننده LCA ، CEP290 ، GUCY2D ، CRB1 و RPE65 اغلب جهش یافته هستند. به ویژه، حدود 6٪ موارد LCA ناشی از جهش در RPE65 است. تا به امروز، هیچ درمان قابل توجهی برای LCA یافت نشده است، این رویکرد در تحویل ژن RPE65 توسط ویروس مرتبط با آدنو (AAV) به شبکیه در بیمارانی است که فاقد پروتئین عملکردی RPE65 هستند.
CRISPR-Cas9 ابزاری برای ویرایش ژنوم است که می تواند منجر به درج ژنها یا حذف جهش ها توسط ترمیم هومولوژی (HDR) یا پیوستن انتهای غیرمستقیم (NHEJ) شود. اگرچه فراوانی HDR به طور کلی پایین تراز NHEJ است توانایی HDR در اصلاح جهش های بیماری زا بطوردائم پتانسیل بسیار خوبی برای درمان اختلالات ژنتیکی مختلف دارد.
ما فرض کردیم که CRISPR-Cas9 می تواند یک درمان دیگر برای LCA باشد و نتایج درمانی HDR با واسطه CRISPR-Cas9 را در موش های rd12، یک مدل از LCA انسانی که دارای یک کدون توقف زودرس مرتبط با بیماری است در Rpe65 آزمایش نمودیم. ما از فناوری CRISPR-Cas9 برای اصلاح جهش مزخرف در این مدل استفاده کردیم ودریافتیم که HDR و درون قاب NHEJ در پاسخ به شکاف DNA با واسطه CRISPR-Cas9 به بهبود عملکردهای شبکیه ومحافظت در برابرانحطاط شبکیه منجر شده است. نتایج حاصل از این مطالعه اثبات مفهوم، امکان سنجی رویکرد ما را نشان می دهد و نشان می دهد که HDR با واسطه CRISPR-Cas9 می تواند به سایر بیماری های چشم پزشکی که در آن HDR مورد نیاز است، گسترش یابد.
مشخصه بالینی آموروز مادرزادی Leber (LCA) شروع اختلال بینایی شدید درزمان تولد است. این اشکال از نابینایی نوزادی نمایانگرشدیدترین دیستروفیهای شبکیه ای ارثی (IRD) بدون ویژگی های مهم سیستمیک است و با نقص دیداری شدید، نستاگموس، مردمک های لاغرویک الکتروتورینوگرام به شدت غیرطبیعی یا غیرقابل تشخیص (ERG) مشخص می شود.
مواد و روش ها
کشت سلول وانتقال سلولی
MEF در محيط اصلاح شده Eagle Dulbecco (DMEM) همراه با گلوکز (4/5 گرم در ليتر)، 4 ميلي مولار گلوتامين، 1ميلي مولارسديم پيروات، سرم گاوي10 درصد، پني سيلين (100 U / ml) و استرپتومايسين (100 ميلي گرم در ليتر) نگهداري شد. RNPs و 120 mer-ssODN با استفاده از Neon Transfection تولید شدند. به طور خلاصه، سلول های 2.5 × 2.5 با مواد برای ترانسفکشن مخلوط شدند و با رعایت یکسری نکات 10، میکرولیتر در سیستم نئون برای 30 میلی گرم در 1350 ولت برای یک پالس درمعرض شوک الکتریکی قرار گرفتند. پنج روز بعد از ترانسفکسیون، سلول ها جمع آوری و DNA ژنومی با استفاده از کیت DNeasy Blood and Tysue) (Qiagen استخراج شد. برای انتقال سلولهای HEK293، سلولها دراندازه 2 × 105 در هر چاه، 24 روز قبل از ترانسفکشن قرار داده شدند. یک میکروگرم پلاسمیدهایی که SpCas9 بهینه سازی شده و sgRNA انسانی را رمزگذاری می کنند با 2 میکرولیتر لیپوفکتامین 2000 (Invitrogen) در 200 میکرولیتر از Opti-MEM مخلوط شدند، به مدت 20 دقیقه باقی مانده وسپس آنها را به سلولهایی اضافه کردند که در 500 میکرولیتر از DMEM به 70٪ تلاقی رسیده بودند. پس از آن، DNA ژنومی پس از 5 روز از ترانسفکشن استخراج شد.
نتایج
- ویرایش CRISPR-Cas9 با واسطه Rpe65 در شرایط آزمایشگاهی:
برای استفاده از فناوری CRISPR-Cas9 برای درمان LCA، ما ابتدا توالیهای RNA راهنمائی واحد (sgRNA) با هدف RP65 اگزون 3 در منطقه را که با مکان جهش بی معنی C-T-T با استفاده ازفیبروبلاستهای جنینی موش (MEF) از موشهای rd12 مورد هدف قرار گرفته، از9مورد بالقوه آزمایش شده، sgRNA TS4 برای مطالعات بیشتر انتخاب شد زیرا باعث ایجاد دو رشته ای (DSB) در نزدیکترین مکان از کدون توقف زودرس شد و سبب درج یا حذف گردید.در مرحله بعد، ما فرکانس های تصحیح شده توسط HDR ناشی از TS4 sgRNA و اهدا کننده Rpe65 در MEF های rd12 را بررسی کردیم. جهش های مترادف برای جلوگیری از شکاف خود اهدا کننده یا بازپس گیری محل تعمیر شده Rpe65 پس از اصلاح، در دنباله اهدا کننده وارد شدند. الیگودوکسینوکلئوتید تک رشته ای (ssODN) به عنوان یک اهدا کننده Rpe65 مورد استفاده قرار گرفت و در محدوده 3 تا 6٪ از اصلاحات ناشی از آن استفاده شد. هنگامی که NHEJ با توالی عمیق مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت، ایندل های با واسطه TS4 sgRNA توسط حذف تسلط یافت، و تقریباً یک چهارم جهش ها با القاب درون فریم مطابقت دارد. در بین ایندل های درون فریم، حذف های یک کدون 5.6٪ را شامل می شود. از آنجا که ایندل درون فریم می تواند منجربه حذف کدون توقف زودرس Rpe65 از موش rd12 گردد، ما پیشنهاد می کنیم ویرایش NHEJ با واسطه نیزممکن است در اثرات درمانی CRISPR-Cas9 نقش داشته باشد. این داده ها نشان می دهد که ما یک توالی sgRNA بهینه شده برای ویرایش ژنوم درمانی، SPR-Cas9 را برای درمان این بیماری شناسایی نمودیم.
- ویرایش ژنوم Rpe65 با استفاده ازسیستم دوگانه AAV در شرایط غیر آزمایشگاهی:
برای ارزیابی اثربخشی درمانی ویرایش بی معنی RSP65- CRISPR-Cas9 با واسطه جهش بی معنی Rpe65 در یک مدل بیماری، ما یک نوکلئوتید در TS4 را برای طراحی SGRNA TS4rd12، که کاملاً مطابق با توالی مکان جهش Rpe65 اگزون 3 در موش rd12 است، تغییردادیم. ما نسبت اجزای AAV را با تغییر غلظت آنها بهینه سازی کردیم تا نتایج ویرایش ژنوم به حداکثر برسد. دوز کم یا بالا از AAV ها از طریق تزریق زیر جلدی در موش های rd12 3 هفته ای انجام شد. پس از 4 هفته از درمان AAV، منطقه مورد نظر Rpe65 با توالی عمیق با استفاده از سلولهای شبکیه و اپیتلیوم رنگدانه شبکیه (RPE) مورد بررسی قرار گرفت. تزریق زیر جلدی منجر به ایجاد میزان indel در شبکیه و RPE می شود که به 20٪ reached رسیده اما بسته به پارامترهای مختلف متغیر است. تزریق زیر قطره‌ای با دوز کم به ترتیب میزان کم و زیاد ایندل را در شبکیه و RPE ایجاد کرد. این نتیجه نشان می دهد که تزریق AAV زیر جلدی در RPE در مقابل شبکیه کارآمد تراست. این نتیجه گیری بیشتر با یافتن تعداد کپی AAV بالاتر در هر سلول دیپلوئیدی (شکل 2D و شکل S2) در RPE تأیید شد. از آنجا که یک مطالعه قبلی نشان داد که استفاده از نسبت زیاد (10: 1) از sgRNA ها و اهدا کننده به Cas9 باعث افزایش بیشتر در دفعات اصلاح در مدل موش از بیماری کبد، مقدار بیش از حد AAV- TS4rd12- اهدا کننده نسبت به AAV-SpCas9 (نسبت AAV-SpCas9: AAV-TS4rd12-اهدا کننده 0.1: 1.9) آزمایش شد، اما منجر به فرکانس پایین ترایندل درهردو بافت پس از تجویز زیر جلدی در مجموع، این داده ها نشان می دهد که تحویل زیر قطبی یک روش کارآمد برای القاء ویرایش Riv65 داخل بدن بوده و نسبت Cas9 به sgRNA برای ویرایش بهینه بسیارمهم میباشد.
بحث
در این مطالعه ، HDR با واسطه CRISPR-Cas9 به عنوان یک درمان جدید برای LCA مستقر شده است. ما نشان دادیم که تحویل دو واسطه AAV از CRISPR-Cas9 و یک دنباله اهدا کننده Rpe65 می تواند به اصلاح جهش ایجاد کننده بیماری در Rpe65 و بهبود عملکرد شبکیه در مدل موش LCA منجر شود. علاوه بر این پیشرفت، مطالعه ما یک سطح بهبودی عملکردی را نشان می دهد که از حد تصحیح ژن اندازه گیری شده است. نتایج تحریک آمیز است زیرا در سلولهای پستمیتوتیکی، وقایع HDR معمولاً نادر میباشد. با این حال، مشاهدات ما توسط مطالعات اخیر نشان می دهد که وقایع HDR با واسطه CRISPR-Cas9 درسلولهای عصبی پس از زایمان و ماهیچه ها پشتیبانی می شوند. نتایج ما همچنین توسط مطالعات قبلی که در آن درمان CRISPR-Cas9 برای برخی بیماریهای مغلوب اتوزومی، مانند دیستروفی عضلانی دوشن و رتینیت پیگمنتوزا انجام شده است، انجام شده است که منجربه بهبود عملکردی فراتراز سطح مورد انتظار از فرکانس تصحیح ژن می شود. این نتایج نشان می دهد که HDR را می توان دراین سلول های پس از زایمان فعال کرد و نتایج درمانی بیش از حد انتظارازسطح ویرایش را می توان در برخی موارد بدست آورد.
ژن درمانی با استفاده ازویروس ها به عنوان ابزاری برای بیان بیش از حد نسخه های وحشی ژنهای ناقص ومرتبط با بیماری عمل می کند. به عنوان مثال، Luxturna، ژن درمانی تأیید شده توسط FDA برای LCA، از AAV2 برای بیان عملکردی RPE65 برای جایگزینی پروتئین جهش یافته پروتئین RPE65 مربوط به LCA استفاده می کند. انواع مختلفی از ویروس ها، مانند لنتی ویروس و رتروویروس نیز می توانند برای ژن درمانی استفاده شوند. اگرچه AAV برای ژن درمانی بسیار جذاب است زیرا در ژنوم میزبان ادغام نمی شود، اما قابلیت بسته بندی محموله محدود آن در بسیاری موارد کاربرد آن را مانع می شود. بنابراین، برای برخی از بیماری های چشمی مانند بیماری استارگارد یا سندرم اوشر که نیاز به تحویل قطعات DNA بزرگ دارند، رویکرد ما با استفاده از HDR با واسطه CRISPR-Cas9 می تواند از نظر درمانی مناسب باشد. علاوه بر این، به دلیل اینکه توالی ازنوع وحشی مورد نظر می تواند در محل ژنومی جایی که ژن باید وجود داشته باشد، جایگزین توالی جهش یافته توسط HDR، سلول های اصلاح شده با HDR می توانند ژن های معرفی شده را در سطح درون زا بیان کنند. در این مطالعه، CRISPR-Cas9 به طور تصادفی با تزریق زیر جلدی در موش rd12 وارد شد زیرا موشها فاقد ماكولا، مركزوهسته بینایی درانسان هستند. تزریق منجر به فرکانس تصحیح ژن تقریباً 3٪ توسط HDR و درون فریم NHEJ و منجر به بهبود قابل توجه در اندازه گیری های الکتروتورینوگرافی شد. ما انتظار داریم که این نتایج در موشها در بیماران مبتلا به LCA بهترشود زیرا چشم پزشکان می توانند تزریق زیر جلدی را در نزدیکی ناحیه ماکولا انجام دهند و امکان ویرایش متمرکز در اطراف این ساختار را فراهم می کند تا حتی ترمیم بینایی بیشتری پیدا کند.
به عنوان اولین مطالعه از CRISPR-Cas9 وحشی SpCas9 که رایج ترین شکل Cas9 است برای درمان LCA استفاده کردیم. برای کاهش فراوانی جهش های خارج ازهدف، نسخه های با اطمینان بالا از Cas9 [HFCas9 ، eCas9 ، HypaCas9 ، SniperCas9 ، یا AAV هدفمند (AAV))] قابل آزمایش است. ما دریافتیم که SniperCas9 با کاهش قابل توجهی در فرکانس های ایندل در سایت های خارج از هدف که توسط SpCas9 شناخته شده است همراه بود. علاوه براین، SniperCas9 فعالیت قابل مقایسه ای را در برابرهدف mRosa26 نشان داد. این نتایج نشان می دهد که ممکن است رویکردهای مختلفی برای کاهش جهش های خارج از هدف در مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گیرد. علاوه بر این، جهش های خارج از هدف که در این مطالعه مشاهده شده اند ممکن است به دلیل اختلاف بین ژنوم انسان و موش در کلینیک یافت نشوند. قابل توجه است که 7 ماه پس از تزریق زیر جلدی هیچ تغییر مورفولوژیکی مشخصی در RPE مشاهده نشده است، نشان می دهد که جهش های خارج از هدف اثرات مضر مشخصی را اعمال نمی کنند.
در نتیجه، ما یک روش جدید، مبتنی بر CRISPR-Cas9 برای درمان LCA ارائه می دهیم. هیچ گزارش قبلی اصلاح داخل بدن با واسطه HDR را در مدلهای حیوانی بیماریهای چشمی نشان نداده است. روش ویرایش ژنوم دائمی درمانی ما می تواند به تنهایی یا همراه با ژن درمانی یا پروتئین درمانی برای درمان LCA استفاده شود.
منابع:
- Jo, D. H., et al. (2019). “CRISPR-Cas9-mediated therapeutic editing of Rpe65 ameliorates the disease phenotypes in a mouse model of Leber congenital amaurosis.” Sci Adv 5(10): eaax1210.
- Thompson, J. A., et al. (2017). “The genetic profile of Leber congenital amaurosis in an Australian cohort.” Mol Genet Genomic Med 5(6): 652-667.
