معرفی کامل الایزا علت، آزمایشات مرتبط و نحوه کار با آن!

معرفی کلی

سنجش ایمنی جاذب مرتبط با آنزیم (ELISA) یک روش سنجش ایمنی

با برچسب است که

به عنوان استاندارد طلایی سنجش ایمنی در نظر گرفته می­شود.

این آزمایش ایمونولوژیک بسیار حساس است و برای شناسایی و

کمی­سازی مواد از جمله

آنتی­ بادی ­ها، آنتی ­ژن ها، پروتئین ها، گلیکوپروتئین ها و هورمون

ها استفاده می­شود.

تشخیص این محصولات با کمپلکس شدن آنتی­ بادی ها و آنتی­ ژن

ها انجام می شود تا نتیجه قابل

اندازه­ گیری ایجاد شود.

آنتی­ بادی  یک نوع پروتئین تولید شده توسط سیستم ایمنی بدن

یک فرد است.

این نوع پروتئین مناطق­ خاصی دارد که به آنتی ­ژن ها متصل می­شوند.

آنتی­ ژن پروتئینی است که می­تواند از برخی منابع خارجی تأمین شود

و در صورت اتصال به آنتی

­ بادی،باعث ایجاد حوادث ناگهانی از طریق سیستم ایمنی بدن می­شود.

این کنش و واکنش در آزمایش

ELISA مورد استفاده قرار می­گیرد و امکان شناسایی آنتی­ بادی ها و

آنتی­ ژن های پروتئینی خاص

فقط با مقدار کمی از نمونه آزمایش را فراهم می کند.

آزمایش ELISA در تشخیص عفونتHIV ، کوید ۱۹، آزمایش های بارداری

و خونریزی و سایر موارد

استفاده می شود.

علت شناسی و اپیدمیولوژی

دو تیم تحقیقاتی مختلف به صورت همزمان ELISA را توسط دانشمندان

Eva Engvall و Peter Perlman و Van Weemen و Schuurs اختراع کردند

ELISA   با اصلاح روش آزمایش رادیویی (RIA) ساخته شد.

این کار با ترکیب آنتی ­ژن و آنتی ­بادی برچسب خورده با آنزیم ها به جای ید

رادیواکتیو ۱۲۵ انجام شد.

روش جدید ابتدا با تعیین سطح IgG در سرم خرگوش استفاده شد.

در همان سال، دانشمندان توانستند با استفاده از پراکسیداز ترب کوهی،

گنادوتروپین جفتی­انسان را در ادرار دارای کمیت کنند.

از آن زمان، روش ELISA در زمینه های مختلف کاربردی مورد استفاده قرار

گرفت و به یک روش تحقیق آزمایشگاهی

و تشخیصی معمول در سراسر جهان تبدیل شد.

اولین روش ELISA شامل مولکول ها و بسترهای گزارشگر کروموژنیک

برای

ایجاد تغییر رنگ قابل مشاهده است که وجود آنتی­ژن را کنترل می کند.

پیشرفت بیشتر در روش ELISA منجر به ایجاد گزارشگرهای فلوروژنیک،

کمی

PCR و الکتروشیمیلومینس برای تولید سیگنال می شود.

با این حال، برخی از این تکنیک ها به استفاده از بسترهای متصل به

آنزیم متکی

نیستند و به گزارشگرهای غیر آنزیمی

که از اصل ELISA استفاده می­کنند، متکی هستند.

آخرین تحول در سال ۲۰۱۲ برای یک الایزا مبتنی بر آنزیم فوق حساس

بود که

نانوذرات را به عنوان گزارشگرهای

کروموژنیک دستکاری می­کرد.

این روش می­تواند سیگنال رنگی را که با چشم غیر مسلح قابل مشاهده

است،

با رنگ آبی برای نتایج مثبت و

رنگ قرمز برای نتایج منفی، ایجاد کند.  با این حال، این روش کیفی است

و برای

همین می تواند فقط وجود یا

عدم وجود یک ماده تجزیه کننده را تعیین کند و غلظت و کمیت آن را تعیین

نمی­کند.

الزامات و روش نمونه

الایزا در صفحات پلی­استایرن که معمولاً در صفحات ۹۶ چاه (یا ۳۸۴ چاه)

که

برای اتصال پروتئین بسیار قوی پوشانده شده اند، انجام می­شود.

بسته به نوع  ELISA، آزمایش نیاز به یک آنتی­بادی تشخیص اولیه،

یا آنتی­ ژن ، آنتی­ آنتی ­ژن، آنتی ­بادی/ آنتی ­ژن پوشش دهنده، بافر،

شستشو و سوبسترا/ کروموژن دارد.

آنتی­ بادی تشخیص اولیه  یک آنتی­ بادی خاص است که تنها با اتصال به

پروتئین مورد نظر واکنش می­دهد، در حالی که یک  آنتی­ بادی ثانویه تشخیص،

آنتی ­بادی آنزیم کونژوگه دوم است که وظیفه مقید کردن یک آنتی ­بادی اولیه

را دارد که همانطور که گفته شد آنزیم کونژوگه است.

چهار مرحله اصلی برای انجام آزمایش سنجی الایزا وجود دارد.

 این مراحل عبارتند از:
  1. پوشش (با آنتی­ژن یا آنتی­بادی)
  2. مسدود کردن (معمولاً با افزودن آلبومین سرم گاوی [BSA])
  3. ردیابی
  4. خواندن نهایی

تشخیص با افزودن بستری انجام می­شود که می­تواند رنگ ایجاد کند.

بسترهای زیادی برای استفاده در تشخیص ELISA در دسترس است.

با این حال، پراکسیداز ترب کوهی (HRP) و آلکالن فسفاتاز (ALP) بیشتر

مورد استفاده قرار می­گیرند.

بستر HRP پراکسید هیدروژن است و منجر به تغییر رنگ به رنگ آبی

می شود

ALP   پس از دوره ­های  انکوباسیون(نهان شدگی) در دمای اتاق ۱۵ تا

۳۰ دقیقه،

رنگ زرد نیتروفنول را اندازه گیری می­کند و معمولاً از

P-Nitrophenyl-phosphate (pNPP)

به عنوان بستر خود استفاده می­کند.

بین هر یک از چهار مرحله فوق یک ” شستشو”  صفحه با استفاده

از یک  بافر، مانند

محلول نمکی بافر فسفات (PBS) و یک شوینده غیر یونی، برای حذف

مواد

غیرقابل اتصال انجام می شود.

در هر مرحله شستشو، بسته به پروتکل خاصی که دنبال می­شود،

چاه ها

دو یا چند بار شسته می­شوند.

در پروتکلELISA ، معمولاً میزان رقیق بودن غلظت ها بصورت سریالی

در چاه

های صفحه قرار می­گیرد.

پس از اندازه گیری نتایج، یک منحنی استاندارد از داده های مجموعه

با غلظت

در محور x با استفاده

از مقیاس ورود به سیستم و جذب در محور y با استفاده از مقیاس

خطی

رسم می­شود.

ELISA برای اهداف تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می­شود.

بیماری های شناسایی شده توسط

ELISA شامل HIV ، HBV، آنفلوانزا، کم خونی همولیتیک، بیماری

لایم،

آلرژی غذایی و غیره است.

در حال حاضر، تعداد زیادی کیت ELISA وجود دارد که توسط تولید

کنندگان

در سراسر جهان تهیه می­شود.

اما برخی از کیت های ELISA فقط در تحقیقات استفاده می­شوند

و نمی­توانند

در تشخیص استفاده شوند.

کوزابیو یکی از تولیدکنندگانی است که کیت های ELISA را برای

استفاده

تحقیقاتی ارائه می­دهد.

و یکی از کاربرد های اخیر و پر طرفدار، استفاده از تکنیک الایزا

برای

تحقیقات در زمینه ویروس کرونا می­باشد.

ازمایش الایزا

ELISA چگونه کار می کند؟

اصول سنجش ایمنی جاذب مرتبط با آنزیم (ELISA) بسیار شبیه

به سایر فن آوری

­ های سنجش ایمنی است.

الایزا قادر به تولید آنتی­ بادی های خاص برای اتصال آنتی­ ژن هدف

است و یک

سیستم تشخیص برای نشان

دادن وجود و مقدار اتصال آنتی­ ژن دارد.

به منظور به حداکثر رساندن حساسیت و دقت سنجش، صفحه باید

با دقت با آنتی­

بادی­ های با میل بالا پوشانده شود.

تست های تشخیصی

سنجش های جاذب ایمنی مرتبط با آنزیم (الایزا) در بسیاری از آزمایش

های

تشخیصی اعمال می شود.

برخی از موارد استفاده از ELISA می­تواند موارد زیر باشد:

وجود آنتی­ بادی در خون را شناسایی و اندازه گیری
کنید
  • آنتی ­بادی های خودکار مانند anti-dsDNA ،anti-dsg1،ANA و غیره
  • آنتی­ بادی علیه بیماری عفونی (ضد باکتری ، ضد ویروس ، ضد قارچ)
  • هپاتیتA ، B،C ،HIV و غیره
سطح تومور مارکر ها را شناسایی و تخمین بزنید
  • آنتی­ ژن اختصاصی پروستات (PSA)
  • آنتی­ ژن کارسینوآمبریونیک (CEA)
سطح هورمون ها را شناسایی و تخمین بزنید
  • هورمون رنگدانه ساز
  • هورمون محرک فولیکولی
  • پرولاکتین
  • تستوسترون
  • گنادوتروپین جفتی انسانی (hCG)
ردیابی شیوع بیماری
  • وبا
  • HIV
  • آنفلوانزا

شناسایی قرار گرفتن در معرض گذشته

(کشف آشکاری مربوط به امراض گذشته)
  • HIV
  • بیماری لایم
  • هپاتیت
غربالگری خون اهدایی برای بررسی
وجود آلودگی های ویروسی احتمالی .
  • ضد HIV-1/2
  • ضد HCV
  • HBsAg
تشخیص سو مصرف مواد مخدر.
  • آمفتامین
  • مت آمفتامین
  • ۳،۴-متیلن دیوکسی ممت آمین
  • کوکائین
  • بنزوئیل کلونین
عوامل تداخل

عواملی که می­توانند در آزمایش مناسب ELISA تداخل کنند، می­توانند

در هر مرحله از فرآیند آزمایش که با جمع آوری نمونه آغاز می­شود، رخ دهند.

کیفیت و یکپارچگی صفحه سنجش، بافر پوشش، آنتی ­بادی جمع آوری

کننده، بافر مسدود کننده، آنتی ­ژن هدف، آنتی­ بادی تشخیص، آنزیم مزدوج،

شستشو، بستر و تشخیص سیگنال می تواند در آزمایشELISA تداخل

ایجاد کند.

برخی از عواملی که می­توانند در آزمایش دخالت کنند،

موارد زیر است:
  • سنجش صفحه: شکل و کیفیت چاه ها ، مواد صفحه ،
  • پیش فعال سازی احتمالی، پوشش یکنواخت یا ناهموار
  • PH بافر: آلودگی
  • آنتی­بادی ضبط و تشخیص: زمان انکوباسیون، دما، ویژگی، تیتر، میل
  • بافر مسدود کننده: واکنش متقابل، غلظت، آلودگی
  • آنتی­ژن هدف: ترکیب، پایداری، اپی توپ
  • آنزیم مزدوج : نوع، غلظت، عملکرد، واکنش متقابل
  • شستشو: آلودگی، فرکانس، حجم، مدت زمان، ترکیب
  • بستر: کیفیت/ تولید کننده
  • تشخیص: عوامل وابسته به ابزار
  • خواننده / خطای انسانی
۴ نوع الایزا
مقایسه الایزا مستقیم، غیرمستقیم،
ساندویچی، رقابتی

الایزا را می­توان با تعدادی اصلاح در روش اصلی انجام داد مانند: مستقیم،

غیرمستقیم، ساندویچی یا رقابتی.

درمرحله کلیدی، بی­حرکتی آنتی­ ژن مورد علاقه، می­تواند با جذب مستقیم

به صفحه آزمایش یا به طور غیر مستقیم

از طریق آنتی­ بادی جمع­آوری شده ای که به صفحه متصل شده است،

انجام شود.

سپس آنتی ­ژن به طور مستقیم (آنتی­بادی اولیه دارای برچسب آنزیم)

یا به طور غیرمستقیم

(آنتی­ بادی ثانویه با آنزیم) شناسایی می-شود.

آنتی­ بادی های تشخیصی معمولاً با آلکالن فسفاتاز (AP) یا پراکسیداز ترب

(HRP)

برچسب گذاری می­شوند.

انتخاب زیادی از بسترها برای انجام ELISA با یک ترکیب HRP یا AP در

دسترس است.

انتخاب بستر بستگی

به حساسیت سنجش مورد نیاز و ابزار دقیق موجود برای تشخیص

سیگنال

(اسپکتروفتومتر ، فلورومتر یا لومینومتر) دارد.

۱- الایزا مستقیم

در ELISA مستقیم، فقط از یک آنتی­ بادی اولیه با مارک آنزیمی

استفاده می­شود،

به این معنی که آنتی­بادی های ثانویه مورد نیاز نیستند.

آنتی­ بادی اولیه دارای برچسب آنزیم “مستقیم” به هدف (آنتی ­ژن)

متصل

می شود که به صفحه (سطح جامد) بی حرکت است.

در مرحله بعد ، آنزیم مرتبط با آنتی­ بادی اولیه با بستر آن واکنش

داده و

سیگنالی قابل رویت را تولید می­کند که قابل اندازه­گیری است.

به این ترتیب آنتی­ژن مورد نظر شناسایی می­شود.

مزایا:

سریع است زیرا فقط یک آنتی­ بادی و مراحل کمتری استفاده می­شود.

واکنش متقاطع آنتی­ بادی ثانویه از بین می­رود.

معایب:

Cell Smear :  چسباندن سلول های غیر تابع و غیر متصل روی

لامل توسط پیوند

شیمیایی انجام می­شود.

بر اثر برچسب زدن با آنزیم ها یا برچسب ها، ممکن است بر

عدم واکنش آنتی­

بادی اولیه تأثیر منفی بگذارد

و قدرت واکنشگری ایمنی آنتی­ بادی اولیه ممکن است تحت

تاثیرلیبل شدن با

آنزیم قرار بگیرد.

برچسب زدن آنتی بادی ­های اولیه برای هر سیستم خاص

ELISA بسیار وقت

گیر و گران است.

عدم انعطاف پذیری در انتخاب برچسب آنتی ­بادی اولیه از یک

آزمایش به آزمایش

دیگر.

حداقل تقویت سیگنال

 ۲ – الایزا غیر مستقیم

در الایزا غیرمستقیم ، هم از آنتی ­بادی اولیه و هم از آنتی­

بادی ثانویه استفاده

می­شود.

اما در این حالت ، آنتی­ بادی اولیه با آنزیمی برچسب گذاری

نشده است.

در عوض، آنتی­ بادی ثانویه با یک آنزیم برچسب گذاری می­شود.

آنتی­ بادی اولیه به آنتی­ ژن بی حرکت به صفحه متصل می­شود

و سپس آنتی

­بادی ثانویه با مارک

آنزیمی به آنتی ­بادی اولیه متصل می­شود. سرانجام، آنزیم مرتبط

با آنتی­ بادی

ثانویه با آن زمینه

واکنش داده و سیگنالی قابل مشاهده را تولید می­کند که قابل

اندازه ­گیری است.

مزایا:

طیف گسترده ای از آنتی­ بادی های ثانویه دارای برچسب به

صورت تجاری

در دسترس هستند.

میتوان گفت همه کاره می­باشد زیرا بسیاری از آنتی­بادی های

اولیه را می­توان

در یک گونه تولید کرد

و از همان آنتی ­بادی ثانویه دارای برچسب برای تشخیص

می­توان استفاده کرد.

حداکثر ایمنی آنتی­بادی اولیه حفظ می شود زیرا برچسب

گذاری نشده است.

حساسیت افزایش می­یابد زیرا هر آنتی­ بادی اولیه حاوی

چندین اپی­توپ است که

می­تواند توسط آنتی­بادی

ثانویه برچسب خورده متصل شود و امکان تقویت سیگنال

را فراهم می­کند.

معایب:

Cell Smear :

چسباندن سلول های غیر تابع و غیر متصل روی لامل

توسط پیوند شیمیایی

انجام می­شود.

واکنش متقاطع ممکن است با آنتی ­بادی ثانویه رخ دهد

و منجر به ایجاد سیگنال

غیر اختصاصی شود.

یک مرحله انکوباسیون اضافی در این روش لازم است.

۳- الایزا ساندویچی

الایزا در الایزا مستقیم و غیرمستقیم ، آنتی ­ژنی است

که در صفحه

بی­ حرکت می­شود.

با این حال، در ELISA ساندویچی، آنتی­بادی است که در

صفحه بی­حرکت

است و به این

آنتی ­بادی،آنتی­ بادی کپچر گفته می­شود.

علاوه بر جذب آنتی­ بادی، ELISA ساندویچی همچنین

شامل استفاده

از آنتی­ بادی­ های

تشخیصی

است که به طور کلی شامل آنتی ­بادی تشخیص اولیه

بدون برچسب

و آنتی­ بادی تشخیص

ثانویه دارای برچسب آنزیم است.

در مرحله اول، آنتی­ ژن مورد علاقه به آنتی­ بادی گیرنده

بی­حرکت در صفحه

متصل می­شود.

در مرحله دوم، آنتی­بادی تشخیص اولیه به آنتی­ژن متصل

می­شود.

در مرحله سوم، آنتی­ بادی

تشخیص ثانویه به آنتی ­بادی تشخیص اولیه متصل

می­شود، و سپس

آنزیم با بستر

خود واکنش

نشان می­دهد و سیگنالی قابل مشاهده را تولید می­کند

که قابل

اندازه گیری است.

الایزا های ساندویچی معمولاً به استفاده از جفت های

آنتی ­بادی

همسان نیاز دارند،

جایی که هر آنتی ­بادی برای یک قسمت متفاوت

(غیر از هم پوشاننده)

از اپی­توپ و

از مولکول آنتی ­ژن خاص است.

اولین آنتی ­بادی (معروف به آنتی­ بادی کپچر) روی چاه

ها پوشانده

می­شود.

سپس محلول نمونه به چاه اضافه می­شود.

برای اندازه­گیری غلظت نمونه، آنتی­ بادی دوم (معروف

به آنتی­بادی

تشخیصی)

این مرحله را دنبال می­کند.

این نوع الایزا مزایای زیر را دارد:

قدرت شناسایی بالا: آنتی ­ژن / آنالیز به طور خاص گرفته

و شناسایی

می­شود.

مناسب برای نمونه ­های پیچیده (یا خام / ناخالص): آنتی

­ژن قبل از

اندازه گیری

به تصفیه نیاز ندارد.

انعطاف پذیری و حساسیت: می­توان از هر دو روش تشخیص

مستقیم

یا غیر

مستقیم استفاده کرد.

مثالی­ از انجام الایزا ساندویچی
( روش گام به گام)
تهیه معرف ها و تجهیزات
بی­ حرکتی آنتی­ بادی:

به هر چاه یک صفحه الایزا ۹۶ چاه آنتی بادی رقیق اضافه کنید.

برای جلوگیری از تبخیر، صفحه را مهر و موم کرده و اجازه دهید

تا آن را

در دمای ۴ درجه سانتیگراد

به مدت ۱۵-۱۸ ساعت انکوبه کنید تا آنتی ­بادی بی­حرکت شود.

شستشو:

آنتی ­بادی رقیق شده را برداشته و ۳ بار با محلول شستشو

بشویید.

مسدود کردن :

به هر چاه بافر مسدود كننده اضافه كنید و اجازه دهید

تا به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انكوبه شود

تا اتصال

غیر­ اختصاصی

پروتئین هدف به چاه كاهش یابد.

شستشو :

بافر انسداد را برداشته و ۳ بار با محلول شستشو بشویید.

افزودن نمونه :

نمونه ها را با بافر رقیق کننده نمونه رقیق کرده و از هر نمونه

۱۰۰ میکرولیتر به

هر چاه اضافه کنید. برای منحنی کالیبراسیون، یک سری میزان

رقیق

بودن استاندارد را در همان صفحه تهیه کنید.

اجازه دهید به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه

شود.

شستشو :

نمونه ها را برداشته و ۵ بار با محلول شستشو بشویید.

افزودن آنتی­بادی تشخیص :

آنتی­ بادی تشخیص را در بافر رقیق کننده نمونه رقیق کرده

و ۱۰۰ میکرولیتر

به هر چاه اضافه کنید.

اجازه دهید به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد

انکوبه شود.

شستشو:

پس از واکنش، آنتی­بادی تشخیص را برداشته و ۵ بار با محلول

شستشو بشویید.

افزودن آنتی­بادی ثانویه با مارک:

آنزیم دارای یک آنتی­ بادی ثانویه با مارک آنزیمی را با نمونه

بافر رقیق کننده رقیق کرده و به هر چاه ۱۰۰ میکرولیتر اضافه

کنید. اجازه دهید

به مدت ۱ ساعت در

دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شود.

شستشو

پس از واکنش ، آنتی­ بادی ثانویه را برداشته و ۵ بار با محلول

شستشو بشویید.

یک محلول بستر اضافه کنید اجازه دهید همزمان با رشد رنگ،

انکوبه شود.

یک محلول توقف برای جلوگیری از واکنش در صورت رشد کافی

رنگ اضافه کنید.

با یک صفحه خوان میزان جذب را در ۴۵۰ نانومتر اندازه گیری کنید.

الایزا رقابتی این کیت ELISA دارای قالب رقابتی است.

ELISA رقابتی ، همچنین به عنوان ELISA بازدارنده

شناخته می­شود و یک روش مبتنی بر سطح / صفحه است ،

که در آن صفحه

با آنتی ­بادی های

گیرنده واکنش پذیر به مولکول مورد نظر پوشانده می­شود.

نمونه (حاوی مولکول محلی مورد علاقه) و پروتئین نوترکیب

کونژوگه آنزیمی

(مولکول رقیب) به

چاه های پوشش داده شده اضافه می­شود.

از آنجا که مقدار مولکول آنزیم کونژوگه در هر چاه ثابت است،

سطح مولکول

محلی موجود در نمونه،

نسبت اتصال مولکول آنزیم کونژوگه در مقابل مولکول بومی

را تعیین می­کند.

پس از یک انکوباسیون، هر آنتی­ بادی غیربسته شده شسته

می­شود.

بستر آنزیمی (به عنوان مثال ، TMB برای HRP)  به هر چاه

اضافه می­شود و

به رسوب آبی رنگ تبدیل

می­شود و مقدار آن به طور خطی با مقدار آنزیم موجود در چاه

متناسب است.

سپس رسوب با افزودن محلول اسید استاپ به رنگ زرد در آمده

و غلظت

رسوب زرد در ۴۵۰ نانومتر برای

جذب نور مقدار OD خوانده می­شود.

سپس OD برای محاسبه میزان مولکول مورد علاقه در هر چاه،

با مقایسه هر چاه نمونه در برابر منحنی استاندارد استفاده

می­شود.

منحنی استاندارد با استفاده از همان اصل تولید می­شود اما

به جای

افزودن نمونه، یک سری مولکول ­های

نوترکیب با غلظت های شناخته شده به ۸-۶ چاه اضافه می­شود.

در مقایسه با سه نوع ELISA بالا ، ELISA رقابتی نسبتاً پیچیده است

زیرا شامل استفاده از آنتی ژن

بازدارنده است ، بنابراین ELISA رقابتی به عنوان ELISA مهار نیز

شناخته می شود.

در واقع ، هر یک از سه قالب مستقیم ، غیرمستقیم و ساندویچی

را می­توان با قالب رقابتی سازگار کرد.

در الایزا رقابتی، آنتی ­ژن بازدارنده و آنتی ­ژن مورد علاقه برای

اتصال به

آنتی­ بادی اولیه با هم رقابت می­کنند.

در اینجا روش الیزا رقابتی است:

در مرحله اول، آنتی­ بادی اولیه بدون برچسب با نمونه حاوی آنتی

­ژن

مورد علاقه انکوباتور می شود

و منجر به تشکیل کمپلکس آنتی ­ژن – آنتی­بادی (Ag-Ab) می شود.

در این مرحله، آنتی­ بادی در مقایسه با آنتی­ژن بیش از حد است ،

بنابراین آنتی­ بادی های آزاد باقی مانده است.

در مرحله دوم ، مخلوط Ag-Ab به صفحه پوشانده شده / کوت شده

با آنتی­ ژن بازدارنده اضافه می­شود که می­تواند

به آنتی ­بادی اولیه نیز متصل شود­.

آنتی­ بادی اولیه آزاد در مخلوط به آنتی ­ژن بازدارنده روی صفحه

متصل

می­شود،در حالی

که کمپلکس های Ag-Ab در مخلوط این کار را نمی­کنند و بنابراین

شسته می­شوند.

در مرحله سوم،

آنتی­ بادی ثانویه دارای برچسب آنزیم به صفحه

اضافه شده و به آنتی­ بادی

اولیه متصل به آنتی ­ژن بازدارنده روی صفحه متصل می­شود.

سرانجام ، یک بستر اضافه می­شود تا با آنزیم واکنش دهد و یک

سیگنال قابل مشاهده برای تشخیص منتشر کند.

از طریق این روش، ممکن است متوجه شوید که سیگنال نهایی

با مقدار آنتی ­ژن مورد نظر در نمونه

رابطه معکوس دارد، به این معنی که هرچه آنتی­ ژن موجود در

نمونه بیشتر باشد، سیگنال نهایی ضعیف تر است.

به این دلیل که آنتی­بادی های اولیه متصل به آنتی ­ژن نمونه شسته

می­شوند، در حالی که آنتی­ بادی های اولیه آزاد

باقی مانده توسط آنتی ­ژن بازدارنده بی­حرکت در صفحه جمع­ آوری

می­شوند و با واکنش آنزیمی اندازه گیری می­شوند.

الایزا رقابتی که در اینجا توضیح داده شده است بر اساس جمع ­آوری

آنتی­ بادی است که

در آن صفحه با آنتی ­ژن پوشانده شده است.

نوع دیگری از ELISA رقابتی وجود دارد که مبتنی بر جذب آنتی­ ژن

است، که در آن صفحه

با آنتی­ بادی بدون برچسب پوشانده می شود.

علاوه بر این، ELISA رقابتی معمولاً از یک آنتی­ بادی دارای برچسب

برای تشخیص استفاده می­کند،

اما گاهی اوقات به جای آنتی­ بادی دارای برچسب، از آنتی­ ژن دارای

برچسب استفاده می شود.

مقایسه فرم های مختلف الایزا
الایزا کمی و کیفی

بر اساس اینکه آیا الایزا می­تواند کمیت سطح مولکول مورد نظر

را تعیین کند یا نه،

الایزا را می­توان به دو نوع کیفی و کمی تقسیم کرد.ELISA کیفی

یک نتیجه مثبت

یا منفی ساده برای یک نمونه فراهم می­کند، در حالی که ELISA

کمی غلظت

مولکول هدف را از طریق یک منحنی استاندارد منعکس می­کند.

بنابراین، اگر می­خواهید کمیت سطح مولکول مورد نظر را تعیین کنید

،ELISA کمی

را انتخاب کنید.

اگر کیت های ELISA برای تجارت شما در دسترس نباشد، می­توانید

ELISA خود

را نیز بسازید.

در طول توسعه ELISA، انتخاب آنتی­بادی از اهمیت حیاتی برخوردار

است.

بسیاری از فاکتورها مانند میل، ویژگی و تیتر آنتی ­بادی باید در نظر

گرفته شود.

روش گام به گام انجام الایزا
  • آماده سازی استاندارد

استاندارد نوترکیبی Lyophilized (ST0000-10) ،

نمونه بافر Dilusent (AR1106-1)

  • میزان رقیق بودن نمونه

نمونه بافر Diluent (AR1106-1)

  • نمونه (آنتی ژن) نهفتگی

صفحه ۹۶-چاه از قبل پوشش داده شده با آنتی­ بادی جمع آوری

شده

  • شستشو

بافر PBS (AR0030)

 

  • تهیه و نهفتگی (incubation (آنتی­ بادی بیوتینیله

آنتی­ بادی (AR1107)biotinylated ،

بافر رقیق کننده آنتی­بادی (AR1106-2)

  • شستشو

بافر PBS (AR0030)

  • آماده سازی و نهان سازی (incubaction)ABC

Avidin-Biotion-Peroxidase Complex ABC (AR1103) ، ABC Dilusent Buffer (AR1106-

  • شستشو

بافر PBS (AR0030)

  • تشخیص سیگنال

عامل توسعه رنگ TMB (AR1104) ، محلول توقف TMB (AR1105)

قبل از اجرای ELISA چه کاری باید انجام دهید

یک آزمایش ELISA همیشه باید در نسخه های تکراری انجام شود تا به

تعداد کافی نمونه

برای محاسبه انحراف استاندارد و ضریب تغییر برسد. ضریب خطا باید

کمتر از ۲۰٪ حفظ شود.

اگر خطای محاسبه شده زیاد باشد، باید خطاهای ناشی از لوله گذاری،

آلودگی صفحات و معرف ها،

تبخیر و  یا دما ارزیابی شوند.

منحنی استاندارد

برای اندازه گیری غلظت نمونه از منحنی استاندارد استفاده می­شود.

ابتدا مقادیر جذب غلظت های استانداردبا یکای (pg / ml) ترسیم می­شود­.

یک منحنی منفی نیز انجام شده است که شامل هیچ داده استاندارد

نمونه ای نیست و برای تشخیص و اندازه گیری noise پس زمینه استفاده

می­شود­.

برای اندازه گیری دقیق، این مقدار پس زمینه باید از منحنی استاندارد

کم شود.

مقادیر جذب غلظت شناخته شده را می توان به عنوان یک کنترل مثبت رسم کرد.

غلظت پروتئین هدف با محاسبه میانگین جذب و سپس استفاده از منحنی

استاندارد

برای تخمین غلظت حاصل می­شود.

عوامل رقیق شدن  نیز باید در نظر گرفته شود. به عنوان مثال، اگر نمونه

چهار برابر

رقیق شده باشد،

قبل از استفاده از منحنی استاندارد، برای جذب غلظت باید جذب را در

چهار ضرب کرد.

ضریب تغییر

تعریف ضریب تغییر نسبت انحراف معیار و میانگین است – یعنی انحراف

معیار

(σ) / و میانگین/ (μ).

مقادیر زیادی از ضریب تغییر نشان دهنده عدم دقت در اثر پیپت یا مخلوط

کردن

معرف ها بین چاه ها،

آلودگی باکتریایی یا قارچی، خشک شدن چاه ها یا تغییرات دما است.

بهبود  میخی ( spike)

مقدار بدست آمده پس از اجرای آزمایش ELISA به چگونگی تعامل یک پروتئین

هدفمند با آنتی بادی ها

بستگی دارد و این برهم کنش با یک منحنی پروتئین استاندارد مقایسه

می شود.

چندین عامل – از جمله بافر،

ماتریس و آنتی بادی های هتروفیل – می توانند بر اتصال نمونه تأثیر بگذارند،

بنابراین این امر باید

هنگام تعیین دقت ELISA در نظر گرفته شود.

برای تعیین صحت نتایج ELISA می توان یک روش میخی را انجام داد.

در این روش، مقدار مشخصی از پروتئین نوترکیب به نمونه افزوده یا اسپایک

می شود.

سپس، با استفاده از منحنی استاندارد، مقدار مواد اندازه گیری می شود.

انحراف زیاد در مقادیر اندازه گیری شده می­تواند خطاهای ناشی از عناصر

ناشناخته در روش را نشان دهد.

روش خطی بودن

از روش خطی نیز برای تعیین صحت ELISA استفاده می­شود.

در این حالت، “نمونه خوشه ای” به صورت سری ۱ به ۲: ۱ ، ۱: ۴ و ۱: ۸ رقیق

می­شود.

اگر غلظت نمونه تغییر یافته تشخیص داده شود و اگر نتایج تغییری خطی در

اندازه گیری ها

نشان ندهد، ممکن است خطاهای صحت ELISA را نشان دهد.

در برخی موارد، ممکن است خطاها در غلظت های خاصی مشاهده شوند

و دیگر در غلظت های

پایین مشاهده نشوند.

در چنین مواردی، ممکن است لازم باشد که نمونه قبل از انجام اندازه گیری

غلظت رقیق شود.

نویسنده :

مهسا محمدهاشمی

 

      

0 پاسخ

دیدگاه خود را ثبت کنید

تمایل دارید در گفتگوها شرکت کنید؟
در گفتگو ها شرکت کنید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *