سلول های بنیادی جنینی ؛و بررسی آن ها

مقدمه

توانایی تقسیم بالا و خودنوزایی دو ویژگی اساسی سلول های بنیادی می باشند. براساس توان تمایزی و برگشت پذیری آن ها، سلول ها را می توان به همه توان، پرتوان و چند توان تقسیم کرد.
همه توان : این سلول ها می توانند همه سلول ها اعم از سه‌لایه‌ی جنینی (اندودرم، مزودرم، اکتودرم) و سلول های برون جنینی را بسازند.
پرتوان : سلول هایی هستند که می توانند غالب یا همه سلول های فرد را بسازند(تنها سه لایه ی جنینی و نه برون جنینی).
چند توان : تعداد محدودتری از انواع سلول را به وجود می آورند ( مثل سلول های بنیادی واقع در بافت های بزرگسالان )

جنینی
🖍سلول های بنیادی جنینی

سلول های بنیادی جنینی (ES ) از توده سلولی داخلیِ در مرحله بلاستوسیست به دست می آیند؛ که این مرحله از تکوین، پیش از لانه گزینی در پستانداران است. که پس از چهار تا پنج روز بعد از لقاح انجام می شود. در این مرحله جنین ۲۰۰_۱۰۰ سلول دارد و به صورت کره ای توخالی است.

این کره متشکل از یک لایه برون سلولی ( تروفواکتودرم ) است که پس از لانه گزینی در رحم، بخشی از جفت را می سازد. این کره دارای مجتمعی از سلول ها در داخل کره به نام توده سلولی داخلی است. حدود ۲۰ سال پیش، روش های کشت سلول های بنیادی موش که از توده سلولی داخلی بلاستوسیست به دست می آیند گزارش شده اند و تاکنون تغییرات بسیار کمی داشته اند.

در سال ۱۹۹۸ توسط تامسون و همکارانش برای اولین بار تولید سلول های بنیادی انسانی گزارش شد. مطالعه سلول های کارسینومای جنینی موش و انسانی به تولید و رشد سلول های بنیادی جنینی کمک کرده است. تاکنون تنها از سه گونه از پستانداران سلول های بنیادی جنینی با توان خودنوزایی و کشت طولانی مدت به دست آمده است که عبارتند از موش، میمون، انسان.

در موش بازدهی تولید سلول های بنیادی جنینی، تحت تاثیر نژاد ژنتیکی موش آزمایشگاهی، شرایط کشت و عواملی است که بر موش های ماده آبستن اثر می گذارد. علاوه بر این تاکنون از گونه های دیگری نیز سلول های بنیادی جنینی تهیه شده است که از آن جمله می توان به موارد گورخرماهی، جوجه، خرگوش، رت، هامستر، خوک، گاو، گوسفند اشاره نمود. تولید رده های سلولی پرتوان از مهره دارانی غیر از موش، اثر عمیقی بر مطالعات مراحل اولیه تکوین نظیر دودمان سلولی متعهد شده و نشانه گذاری ژنتیکی و به خصوص تغییر ژنتیکی و انتقال هسته در گونه های اهلی داشته است.

🖍کلیات تولید سلول های بنیادی جنینی

تولید سلول های بنیادی جنینی از موش یا انسان، فرآیندی چند مرحله ای است. به چند مورد آن اشاره مختصری می کنیم.
۱ : توده سلولی داخلی بلاستوسیست پیش از لانه گزینی از تروفواکتودرم اطراف آن جدا می شود. جداسازی بلاستوسیست به دو روش انجام می گیرد که هر دو روش در تولید سلول های بنیادی جنینی انسان و موش به کاربرد دارد.
الف) مکانیکی، پس از کشت بلاستوسیست، جنین به کف ظرف متصل می شود و سپس سلول های تروفواکتودرمی در سطح شروع به رشد می کنند ولی سلول های ICM به سمت بالا تکثیر می یابند و بعد از چند روز برامدگی گنبدی شکلی درست می کند. در این وقت با کمک یک پیپت می توان ICM را از تروفواکتودرم جدا کرد.
ب) جراحی با کمک ابزار ایمنی: در این روش از ابزارهای ایمنی یعنی کامپلمان و انتی بادی استفاده می شود.
۲ : کشت ICM بر سلول های تغذیه کننده: کشت سلول های تغذیه کننده برای رشد سلول های بنیادی جنینی به منظور تامین مواد ناشناخته مورد نیاز سلول های بنیادی جنینی است.

گاهی نیز سلول های بنیادی جنینی را بدون سلول های تغذیه کننده کشت می دهند ولی این هنگام کشت سلول های بنیادی جنینی نمی تواند برای مدت طولانی باشد. چون احتمالا تمایز خود به خود انها، حتی در حضور LIF به عنوان عامل ممانعت کننده تمایز زیاد است.

در تمامی موارد، تقسیم سلول های تغذیه کننده را قبل از هم کشتی با سلول های بنیادی جنینی متوقف می کنند. ممانعت از تقسیم سلول های تغذیه کننده به دو روش تابش اشعه گاما و با استفاده از مایتومایسین C. انجام می شود.
۳ : با تکثیر ICM بر سلول های تغذیه کننده و پاساژ آنها بعد از گذشت چند روز بر روی سلول های تغذیه کننده، کلونی یا کلونی های ظاهر می شود در این وقت باید آنها را از کف ظرف همراه با سلول های تغذیه کننده جدا کرده و پس از تفکیک سلول ها از یکدیگر دوباره آن را کشت داد. بعد از گذشت چند روز کلونی یا کلونی هایی ظاهر می شود و در این وقت بازهم باید آنها را پاساژ داد.
۴ : حصول سلول های بنیادی جنینی: با پاساژ کلونی ها به صورت تک سلولی بر سلول های تغذیه کننده جدید، بعد از دو یا سه روز کلونی های بزرگتری تشکیل می شود. از این به بعد هر دو یا سه روز یکبار باید انها را پاساژ داد.

نکته جالب آن است که می توان آنها را به مدت طولانی کشت داد، یا برای سالها منجمد نگاه داشت و در شرایط مطلوب، حالت غیرتمایزی و کاریوتیپ طبیعی خود را برای سالها حفظ می کنند.

🖍مشخصات سلول های بنیادی:

برای هدف های تحقیقاتی، تعریف یک سلول بنیادی جنینی، بیش از سلول های بنیادی با توان تقسیم زیاد مشتق از جنین است که می تواند تقریبا به تمام سلول های بدن تمایز یابد. پس نکات با اهمیت و خاص در تعریف سلول بنیادی جنینی ضروری است.
آستین اسمیت مطالعات فراوانی بر سلول های بنیادی جنینی موش دارد. براساس مطالعات فراوانش مشخصات زیر را برای تعریف سلول های بنیادی جنین ضروری می داند.
۱: از توده سلولی داخلی و یا اپی بلاست بلاستوسیست مشتق شده باشد. a
۲ : دارای توان تقسیم متقارن نامحدود و بدون تمایز باشد و در عین حال توان تمایزی را حفظ نمایدa
۳ : دارای کاریوتیپ طبیعی کروموزومی بوده و این حالت را نیز حفظ نماید.
۴ : سلول های بنیادی جنینی پرتوان بتوانند انواع سلول تمایز یافته که مشتق از سه لایه زاینده اولیه جنین ( اندودرم، مزودرم و اکتودرم ) است را به وجود اورد.
۵ : طی تکوین، دارای توان ادغام در تمام بافت های جنینی باشد.a,b
۶: دارای توان تولید دودمان زاینده که در نهایت اسپرم و تخمک را می سازد، باشد. a,b
۷ : کلون زایی به این معنی که یک سلول منفرد دارای توان تولید یک کلونی متشکل از سلول های با خواص ژنتیکی یکسان باشد. انکه کلونها دارای خواص مشابه سلول مبدا باشد. a
۸ : بیان فاکتور نسخه برداری Oct_4 این فاکتور باعث تحریک یا مهار دسته ای از ژنها می شود که سلول های بنیادی جنینی را در حال تکثیری و غیر تمایز نگه می دارد.
۹: بتوان آن را به تکثیر و یا تمایز القا کرد.
۱۰ : فاقد نقطه کنترل G1 باشد.
۱۱ : سلول های بنیادی جنینی، غیر فعال شدن کروموزوم x را نشان نمی دهند.
a: این خصوصیت در سلول های EGC انسانی نشان داده نشده است.
b: این خصوصیت در سلول های بنیادی جنینی انسانی نشان داده نشده است.

همه ی خصوصیات فوق در سلول های بنیادی جنینی موش نشان داده شده است.
علاوه بر این سلول های بنیادی جنینی و سلول های کارسینومای جنینی همانند توده سلولی داخلی بلاستوسیست های موشی تعدادی از نشانگرهای سطحی سلول های پرتوان جنینی را نشان می دهند.

🖍حفظ سلول های بنیادی جنینی در حالت تمایز نیافته

این حالت سلول بنیادی جنینی با مارکرهای سلولی خاص نشان داده می شود. این مارکرها به دانشمندان کمک می کند تا درک بهتری از تکثیر نامحدود سلول های بنیادی جنینی در شرایط مطلوب کشت داشته باشند. ما می توانیم از طریق دو مسیر تحقیقی این شواهد را بدست آوریم.

دو مسیر اصلی تحقیق عبارتند از کوشش هایی که تأثیر فاکتور های ترشحی نظیر فاکتور ممانعت کننده لوکمیایی (LIF) بر سلول های بنیادی جنینی موش در محیط آزمایشگاهی را بررسی می کند و مسیر دوم تحقیق، فاکتور های نسخه برداری نظیر Oct_4 را در بر می گیرد.

LIF، سایتوکاین متعلق به خانواده IL_6است که در سال ۱۹۸۸اثر ممانعت کنندگی آن بر تمایز سلول های بنیادی جنینی موش شناخته شد. Oct_4پروتئینی است که به وسیله سلول‌های بنیادی جنینی انسان و موش در محیط آزمایشگاهی بیان می شود. این فاکتور توسط سلول های ICMموشی در شرایط in vivo نیز بیان می گردد. Oct_4در سلول تخم موش وجود دارد و در سراسر بلاستوسیست تا ظهور ICMو به منظور حفظ پر توانی در ICMو اپی بلاست وجود دارد.

همچنین Oct_4در سلول های زاینده موش(Primordial Germ Cells) بیان میشود. برای حفظ پرتوانی سلول های بنیادی جنینی، بیان Oct_4لازم است. به طوری که اگر از بیان Oct_4جلوگیری کنیم، سلول های بنیادی جنینی به تروفواکتودرم تمایز می یابند. اگر بیان Oct_4را به طور مصنوعی زیاد کنیم، سلول بنیادی جنینی موش به اندودرم و مزودرم ابتدایی تمایز می یابند. پس مقدار بیان Oct_4وضعیت برنامه تکوینی سلول های بنیادی جنینی موش را نشان می دهد.

و آن را به عنوان پروتئین کاندیدای تنظیم کننده اصلی پرتوانی سلول های بنیادی جنینی معرفی می کند. اینکه چرا و چگونه فاکتور نسخه برداری Oct_4جنین نقش مهمی را درتکوین جنین ایجاد می کند به ژنهای تحت کنترل آن، بستگی دارد. نتیجه می گیریم که ممکن است Oct_4سبب ممانعت از عمل ژن هایی شود که برای تمایز لازم هستند.
موضوع پرتوانی سلول های بنیادی جنینی به چهار بازیگر مهم یعنی FoxD3, Oct_4, Sox2وStat3بر می گردد. ولی اجرای کنسرت پرتوانی با هیچ کدام از این عوامل به تنهایی شروع نمی شود چون به بازیگر دیگری نیاز دارد.

Oct_4برای تنظیم سرنوشت سلولی در جنین ابتدایی ضروری است و در توده سلولی داخلی بیان می شود و بیان آن در تروفوبلاست کاهش می یابد. FoxD3و Sox2دیرتر در جنین بیان می شوند و در حفظ اپی بلاست بعد از لانه گزینی ضروری هستند.

در سلول های بنیادی جنینی Stat3با سیستوکین LIFفعال می شود و این فرآیند برای حفظ خود‌ نوزایی آنها ضروری است. ولی برای تکوین طبیعی موش به LIFنیازی نیست. تاکنون دو فاکتور رونویسی Stat3و Oct_4شناخته شده اند که در خود نوزایی سلول های بنیادی جنینی شرکت دارند.

ولی اخیرا یک فاکتور رونویسی همئوباکس شناخته شده که در سلول های داخلی مورولا و بلاستوسیست، سلول های زاینده اولیه ، سلول های بنیادی جنینی و سلول های زاینده مشتق از آنها بیان می شود. نام این فاکتور Nanogاست به معنی سرزمین همیشه جوان می باشد.

این فاکتور در دومین رخداد تخصصی شدن سلول های جنینی نقش حیاتی دارد. شناسایی Nanog دیدگاه جدیدی را در کشت سلول های بنیادی جنینی مطرح کرد. طوری که تاکنون اعتقاد داشتند که حفظ نوزایی سلول های بنیادی جنینی به همکاری Stat3فعال شده و تجلی Oct_4نیاز دارد.

اما نشان داده شده است که بیان زیادی Nanogخود نوزایی سلول های بنیادی جنینی را از وابستگی به تحریک LIF/Stat3خلاص می کند. ولی در این شرایط باز هم سلول ها به خود نوزایی خود ادامه می دهند.بیان زیادی Nanog، قابلیت تمایزی سلول های بنیادی جنینی کاهش می داده و به تأخیر می اندازد.

ولی حذف بیان زیادی Nanogباعث برگشت سلول ها به حالت بنیادی اولیه می شود. از طرفی دیگر حذف Nanogباعث آغاز تمایز سلول های بنیادی جنینی به اندودرم احشایی می گردد و این بیان کننده ی نقش آن در دومین رخداد تمایز جنینی است.

این نتیجه همراه با این مشاهده که LIFو Nanog اثر افزاینده بر خود نوزایی سلول های بنیادی جنینی دارند، پیشنهاد می کند که این دو عامل دو خزانه هدف ژنی متفاوت را کنترل می کنند که تا اندازه ای برهم همپوشانی دارند.

کمبرز و همکاران گزارش کردند که Nanogدر سلسله مراتب رونویسی مداخله کننده در هویت سلول های بنیادی و حفظ پرتوانی آنها شرکت دارند به طوری که بیان زیادی Nanogبر خود نوزایی سلول های بنیادی از طریق فعال کردن Stat3عمل نمی کند و برعکس آن فعال کردنStat3بر بیان Nanogاثر ندارد. علاوه بر این Nanogو Oct_4به صورت کنسرت در حفظ پرتوانی و نوزایی سلول های بنیادی جنینی عمل می کنند.

از بحث های ذکر شده به این نتیجه می رسیم که Nanog, Stat3, Oct_4با سه مسیر رونویسی متفاوت در سلول های بنیادی جنینی عمل می کند. و از مطالعه انواع مسیر های پیام رسانی مشخص می شود که فاکتورهای بسیاری باید در تعادل با هم باشند تا سلول های بنیادی جنینی در حالت نوسازی باقی بمانند. که اگر در این حالت تعادل تغییری به وجود آید، سلول های بنیادی جنینی تمایز می یابند.

جنینی

🖍 تمایز سلول های بنیادی جنینی

می دانیم که، مهمترین هدف ما از تحقیق بر سلول بنیادی جنینی، تکوین سلول های تخصصی مانند نورونها، سلول های عضله قلبی، سلول های اندوتلیال عروق خونی و سلول های مولد انسولین و غیره می باشد.

پس تمایز جهت دار سلول های بنیادی جنینی برای استفاده از آنها در توسعه درمان های جدید بسیار حیاتی است.

سلول های بنیادی جنینی می توانند در شرایط آزمایشگاهی و در موجود زنده به انواع فراوانی از سلول های بدن تمایز کننده. پس این سلول ها پتانسیل فراوانی در ترمیم و جایگزینی سلول ها و بافت های آسیب دیده دارند.

مزایایی که سلول های بنیادی جنینی نسبت به سلول های بنیادی بزرگسالان دارند، توانایی تقسیم نامحدود آنها در محیط آزمایشگاهی و توانایی تمایز وسیع آنها می باشد. معمولا در تمایز سلول های بنیادی، این سلول ها از سلول های تغذیه کننده جدا شده، به صورت سوسپانسیون در پلیت کشت داده می شوند و به تجمعات کروی شکلی مشابه با ابتدای دوران جنینی بعد از لانه گزینی به نام اجسام شبه جنینی(embryoid bodiesتبدیل می شوند. اجسام شبه جنینی، شامل مجموعه ای از سلول های پیش ساز تا سلول های کاملا تمایز یافته هستند. با تزریق سلول های بنیادی جنینی موشی و انسانی به موش های SCID(Severe Combined Immunodeficient)می توان تراتومسی با انواع مشتقات اکتودرمی (مثل اپی تلیوم عصبی)، مزودرمی مثل غضروف و استخوان و ماهیچه، و اندودرمی مثل (لوله گوارش )ایجاد نمود. تشکیل بافت های سازمان یافته طی جنین زایی طبیعی به وسیله ی بسیاری از رخدادهای القایی و در بر هم کنش های پیچیده مزانشیمی اپی تلیایی ایجاد می شود.
در اینجا متذکر می شویم که بعضی از روش ها برای غنی سازی یک سلول تمایز یافته خاص از سلول های بنیادی جنینی در شرایط آزمایشگاهی به کار می روند.
تاکنون روش عمومی برای تمایز جهت دار سلول های بنیادی جنینی، تغییر شرایط کشت سلول های بنیادی جنینی مانند اضافه کردن فاکتور های رشد به محیط کشت و یا تغییر اجزای شیمیایی سطحی بوده که سلول های بنیادی جنینی بر آن رشد کرده اند.

برای مثال ظروف کشت پلاستیکی که برای کشنت سلول های بنیادی جنینی انسانی و موشی به کار می روند را می توان با مواد مختلفی که به سلول ها اجازه چسبیدن می دهند و یا از چسبیدن آنها ممانعت می کنند، تیمار کرد. به طور کلی یک ماده چسبنده به مهار بر هم کنش و تمایز سلول های بنیادی جنینی کمک می کند.

برهم کنش های سلول با سلول برای تکوین طبیعی جنینی بسیار مهم می باشند پس تقلید بر هم کنش های طبیعی که در بدن موجود زنده رخ می دهند، در محیط آزمایشگاهی، استراتژی مهم القای تمایز سلول بنیادی جنینی انسانی و موشی است. افزودن فاکتور های رشد خاص به محیط کشت سبب آغاز فعالیت یا عدم فعالیت ژن های خاصی در سلول های بنیادی جنینی نیز می شود. علاوه بر این سبب شروع یک سری رویدادهای مولکولی می شود که سلول های مزبور را به مسیر تمایزی خاصی سوق می دهد.
راه دیگر برای تمایز جهت دار سلول های بنیادی جنینی، داخل شدن ژن های خارجی به درون آنها از طریق ترانس فیکاسیون و یا روش های دیگر است. نتیجه این استراتژی ها، آن است که یک ژن فعال را به ژنوم سلول بنیادی جنینی اضافه نمایند و به دنبال آن سلول های مزبور وارد مسیر تمایزی خاصی بشوند.
مشخص شده که سلول های بنیادی جنینی قابلیت تمایز به انواع گوناگونی از سلول ها را دارند. مثلا سلول های بنیادی جنینی موش می توانند در محیط ازمایشگاهی تمایز یابند و ساختارهای رگی، نورون های رها کننده دوپامین و سروتونین، سلول های اندوکرینی جزایر پانکراس را به وجود آورند. در تمام موارد فوق سلول های بنیادی جنینی موشی در حالت تمایز یافته مذکور است.

شروع تمایز سلول بنیادی جنینی موشی با حذف سایتوکاین LIF که تقسیم سلول های بنیادی جنینی موشی را افزایش می دهد، نیز آغاز میشود. علاوه براین به هنگام تمایز، سلول های بنیادی به هم وصل می شوند، به طوری که در محیط سه بعدی آنها تغییری به وجود می اید که احتمالا شرایط بعضی از برهم کنش های سلولی را مانند in vivo در شرایط ازمایشگاهی فراهم می کند.

این سه مطالعه مثال های خوبی در تمایز جهت دار هستند. دو مطالعه از این سری نشان داده که یک سلول پیش ساز می تواند انواع گوناگونی از سلول های تمایز یافته را به وجود اورد و هرسه نشان داده اند که سلول های تمایز یافته حاصل، همچون مشابه های خود در in vivoعمل می کنند. این دو خصوصیت یعنی توانایی یک سلول در تولید انواع سلول ها و با صفات عملکردی، اساس یک ازمون قوی برای همه مدعیان تمایز جهت دار از سلول های بنیادی جنینی و سلول های بنیادی غیر جنینی است.

جنینی
🖍کاربردهای بالقوه سلول های بنیادی جنینی

سلول های بنیادی کاربردهای گوناگونی دارد که مشخص ترین انها توان بالقوه این سلول ها در درمان بعضی از بیماریهاست. (باید توجه داشت که اگر سلول های بنیادی جنینی و یا سلول های پرتوان دیگر همچون .

iPS به منظور درمان مورد استفاده قرار گیرند، حتما باید پیش از تزریق آنها به بدن فرد از این موضوع اطمینان حاصل کرد که همه ی این سلول ها به رده ی مورد نظر تمایز یافته اند، در غیر این صورت این سلول ها میتوانند در بدن فرد تومور ایجاد کنند) پیوند سلول های بنیادی جنینی و یا سلول های بزرگسالان در درمان موفقیت امیز بسیاری از بیماری های مزمن مانند دیابت، پارکینسون و اسیب نخاعی، دیستروفی ماهیچه ای دوشن، نقصان کبدی یا قلبی و استخوانی اهمیت دارد.
در سالهای اخیر پیشرفت زیادی در طب پیوند انسانی به وجود آمده است اما هنوز مشکلات زیادی در راه کاربرد وسیع طیف پیوند سلولی تحت این شرایط وجود دارد. منابع اصلی در این زمینه به کارگیری داروهای سرکوب کننده ایمنی برای جلوگیری از دفع بافت پیوندی و کمی مردگان دهنده اندام ها است.
در این راه، سلول های بنیادی انسانی، منبع نامحدود از سلول ها را فراهم می کنند که به آسانی قابل دسترس می باشند .علاوه بر این امکان تغییر ژنتیکی سلول های بنیادی وجود دارد به طوری که بعد از پیوند دفع نشوند .
مرحله ی اول در توسعه موفق درمان بیماری های انسانی یا سلول های بنیادی ایجاد شرایط مناسب برای تمایز سلولی به سلول دلخواه و خالص سازی آن دودمان از جمعیت سلولی است.

سلول های بنیادی جنینی به صورت جمعیت ناهمگنی از سلول ها در شرایط ازمایشگاهی تمایز می یابند و این موضوع استفاده از آنها را محدود کرده است. درحقیقت علی رغم افزودن فاکتورهای رشد خاص، سلول های بنیادی جنینی انسانی گستره وسیعی از بیان ژن ها را دارند. علاوه براین، تنوع قابل توجهی در تمایز سلولی در کشت های با فاکتورهای رشد یکسان دیده می شود.

بنابراین استخراج یک جمعیت نسبتا همگون در مخلوطی از سلول ها نیازمند انتخاب selectionاست. راه حل برای این کار به کارگیری پروموتر خاص بافتی و یک نشان گر، نظیر ژن مقاوم به آنتی بیوتیک می باشد.

راه دیگر انتقال یک سازه ژنی gene constructحاوی یک پروموتر خاص بافتی کنترل کننده بیان ژن پروتئین فلورسنس سبز Green Fluorescence Protein : GFPاست. در این راستا، سلول های دلخواه که بیان کننده GFPهستند با Fluoresecence Activated Cell Sorting جدا می شوند. این روش مانند انتخاب و جداسازی سلول های بنیادی خون ساز CD34+برای پیوند سلولی است. هرکدام از روش های فوق به بازدهی روش های انتقال ژن به سلول های بنیادی وابسته است.

نویسنده: نیلوفر ترکزاده) دانشجو ارشد بیوشیمی واحد فلاورجان اصفهان)

منابع:

۱ : جلد اول سلول های بنیادی نوشته دکتر حسین بهاروند
۲: https://www.mayoclinic.org/tests-procedures/bone-marrow-transplant/in-depth/stem-cells/art-20048117
۳: https://www.stanfordchildrens.org/en/topic/default?id=what-are-stem-cells-160-38
۴: https://stemcells.nih.gov/info/Regenerative_Medicine/2006Chapter1.htm

۵: marshak DR, Gottlieb D, kiger AA Fuller MT Kunath T , Hogan B: STem Cell biology book (New york)
۶: pease m, wang x, wolgemuth Dj ,scoler H, Differential expression of thr Oct_4 transcription factor during mouse germ cell differentiation , mech ,Dev71:89_98

✔بیشتر بخوانید :

 

0 پاسخ

دیدگاه خود را ثبت کنید

تمایل دارید در گفتگوها شرکت کنید؟
در گفتگو ها شرکت کنید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *