تکنیک های آزمایشگاهی

تکنیک الکتروفورز

آشنایی با تکنیک الکتروفورز و انواع آن

الکتروفورز

الکتروفورز تکنیکی است که برای جداسازی و خالص سازی ماکرومولکول هایی مانند پروتئین و اسیدآمینه که در اندازه و بار متفاوت هستند به کار می رود. می توان گفت که الکتروفورز (Electrophoresis) حرکت ذرات پراکنده در داخل مایعی تحت تاثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت است. اما اگر همین حرکت در فضایی با میدان الکتریکی غیر یکنواخت باشد دی الکتروفورز نامیده می شود. هنگامی که مولکول های بارگذاری شده در یک میدان الکتریکی قرار می گیرند، براساس بار الکتریکیشان به سمت قطب مثبت (آند) یا قطب منفی (کاتد) حرکت می کنند.

به سبب اینکه ماکرومولکول های زیستی مانند DNA وپروتئین ها، باردار هستند می توان با قراردادن آن ها در یک میدان الکتریکی، آن ها را بر اساس خواص فیزیکی مانند: شکل فضایی، وزن مولکول و بار الکتریکی تفکیک کرد. برای این منظور از تکنیکی به نام الکتروفورز استفاده می شود که در آن ماکرومولکول های قرار گرفته درون میدان الکتریکی بر اساس بار الکتریکی خود به سمت قطب منفی و یا قطب مثبت حرکت می کنند. سرعت حرکت این مولکول ها علاوه بر بار الکتریکی، به شدت میدان الکتریکی و عواملی نظیر شکل فضایی مولکول، اندازه و وزن مولکول بستگی دارد.

مولکول های کوچک تر سریع تر از مولکول های بزرگ تر حرکت می کنند؛ این امر به دلیل مهاجرت راحت تر آن ها در منافذ ژل می باشد. اما پروتئین ها بر اساس بارشان در آگارز جدا می شوند زیرا منافذ ژل بسیار بزرگ تر از آن هستند که بتوانند پروتئین ها را غربال کنند همچنین تکنیک ژل الکتروفورز می تواند برای جداسازی نانوذرات مورد استفاده قرار گیرد.

عمل الکتروفورز در بافر صورت می گیرد تا از تغییرات PH جلوگیری شود درواقع PH فاکتوری بسیاراساسی و مهم در عمل الکتروفورز می باشد. به علاوه بافر در فراهم نمودن یون های حامل جریان بین دو قطب نقش دارند. بافر تریس استات EDTA (TAE) و بافر تریس بورات EDTA (TBE) از جمله مهمترین بافرهای مورد استفاده برای اسیدهای نوکلئیک می باشند. بافر TAE دارای ظرفیت بافری پایینی می باشد و کیفیت نتایج آن برای توالی های DNA با طول بلند بسیار خوب می باشد. بافرهای دیگری نیز برای الکتروفورز آگارز استفاده می شود که از عمومیت کمتری برخوردارند.

نکته مهم در انتخاب و استفاده از بافرها این است که همیشه از همان بافری که برای تهیه ژل استفاده می شود باید برای پرکردن تانک الکتروفورز استفاده کرد. در هنگام عمل الکتروفورز بسته به اندازه و اختلاف وزنی که جمعیت مولکول ها با هم دارند و نیز میزان ولتاژی که اعمال می گردد، زمان الکتروفورز متفاوت خواهد بود. در صورتی که مدت زمان عمل الکتروفورز کم باشد روی هم افتادن باندها و نیز اسمیرهای غیر قابل تمایز قابل مشاهده خواهند بود. اما اگر مدت زمان این عمل زیاد باشد ممکن است مولکول ها از ژل خارج گردند.

بسته به اینکه الکتروفورز در یک سطح افقی انجام گیرد یا در یک سطح عمودی به ترتیب به نوع روش های مذکور الکتروفورز افقی و الکتروفورز عمودی گفته می شود. در حالت کلی برای انجام کارهای روزمره آزمایشگاه و ارزیابی کیفی نمونه‌ها از الکتروفورز افقی با ژل آگاروز استفاده می‌شود. این روش ارزان‌تر، ساده‌تر و سریع‌تر از روش‌های دیگر قابل انجام است. اما برای دست‌یابی به نتایج دقیق، جداسازی مولکول‌های بسیار کوچک و انجام ارزیابی کمی و آزمون‌های حساس ‌آزمایشگاهی روش الکتروفورز عمودی گزینه بهتری است. از سوي دیگر براساس نوع محیط پایه و مواد شیمیایی مورد استفاده و همچنین نوع مکانیسم جداسازی، روش های الکتروفورزی تنوع زیادي پیدا کرده اند.

در الکتروفورز معمولا از یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی‌اکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می‌شود. با افزایش یا کاهش غلظت ژل های مورد استفاده می توان منافذ ژل را برای جداسازی مولکول های کوچک تر و بزرگ تر مناسب کرد.

الکتروفورز

دستگاه ژل داک

برای مشاهده ژل های الکتروفورز شده با اشعه UV از دستگاه ژل داک استفاده می شود. این دستگاه نور را در محدوده UV و مرئی به ژل می تاباند و مواد حساس به فلوئورسنت که به DNA یا پروتئین چسبیده اند، باند های تشکیل شده را نشان می دهند. این دستگاه معمولا به یک کامپیوتر و دوربین عکاسی نیز متصل می شود.

دستگاه ژل داک
دستگاه ژل داک

انواع ژل

مهمترین انواع ژل مورد استفاده در عمل الکتروفورز ژل آگارز و اکریل آمید می باشند. هر دو نوع ژل می تواند به خوبی برای انواع اندازه ها و گونه های آنالیت مورد استفاده قرار بگیرد. 1- ژل پلی اکریل آمید ژل های پلی اکریل آمید معمولا برای پروتئین ها مورد استفاده قرار می گیرند. معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات) اضافه می‌شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می‌باشد. علت این کار این است که پروتئین‌ها دارای بارهای مختلفی هستند و این موضوع سبب می شود که آزمایش با خطا رو به رو شود. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین‌ها شده و به آن ها متصل می‌شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول‌های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید وهمچنین دارای قدرت تفکیک خیلی بالایی برای قطعات DNA با اندازه بین 5-500 جفت باز می باشند. برای تهیه پلی اکریل آمید باید آن را به طریق پلیمریزاسیون با استفاده از ماده شیمیایی تهیه نمود. 2- ژل آگارز ژل های آگارز دارای قدرت تفکیک کمتری برای DNA می باشند ولی دارای طیف وسیع تری از جداسازی می باشند و بنابراین برای قطعاتی DNA بین 50 تا 20000 جفت باز مناسب می باشند. اما باید این نکته در نظر گرفته شود که برای قطعات DNA بزرگتر از 6 مگاباز باید با دستگاه الکتروفورز PFGE (PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS) قطعات را جدا نمود. برای تهیه آگارز باید آن را به صورت محلول حرارت داد. ژل های آگارز دارای منافذ با اندازه های متفاوت می باشند ولی برای جداسازی پروتئین های با اندازه بیشتر از 200 کیلودالتون می توانند مورد استفاده قرار بگیرند. فاصله بین باندهای DNA دارای طول متفاوت متاثر از میزان درصد آگارز می باشد. اغلب ژل های آگارز از درصد ژل بین 0.7 درصد (برای جداسازی قطعات DNA  بین5 تا 10 کیلو باز ) و 2 درصد (برای جداسازی قطعات بین 0.2 تا 1 کیلو باز) می باشند. ژل های با درصد آگارز بالاتر از 3 ٪ را می توان برای جداسازی قطعات خیلی کوچک استفاده نمود؛ اما برای این قطعات بهتر است از ژل پلی اکریل آمید به صورت عمودی برای جداسازی آنها استفاده شود. برای بسیاری از جداسازی ها ژل 1 ٪ آگارز بهترین مورد می باشد. 3- ژل نشاسته ژل نشاسته اولین ژلی بود که برای جداسازی الکتروفورزی مورد استفاده قرار گرفت. نشاسته بدست آمده از سیب زمینی که به صورت نیمه هیدرولیز گردیده است، محیط مناسب و غیرسمی جهت جداسازی پروتئین ها ایجاد می نماید. در این نوع ژل پروتئین های غیردناتوره می توانند براساس بار و وزن جدا شوند. ژل نشاسته معمولا بین 5 تا 10 درصد می باشد. 4- ژل Native ژل های Native در شرایطی غیردناتوره کننده ران می شوند، بنابراین ساختار طبیعی آنالیت حفظ می شود. این امر موجب تاثیر گذاری شکل مولکول در تحرک آن خواهد شد و بنابراین هر چهار سطح پروتئین قابل بررسی خواهند بود. از آنجایی که در این نوع ژل ها ساختار طبیعی پروتئین ها حفظ می شود، نه تنها می توان آنها را با استفاده از روش های رنگ آمیزی معمول بررسی نمود، بلکه می توان با استفاده از روش های رنگ آمیزی ویژه enzyme-linked آنها را بررسی نمود. ژل الکتروفورز native معمولا برای تحقیقات پروتئومیکس و متالومیکس مورد استفاده قرار می گیرد. اگرچه، native-PAGE نیز می تواند برای اسکن ژل های حاوی جهش های ناشناخته مانند تکنیک SSCP مورد استفاده قرار بگیرند. 5- ژل واسرشت کننده در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم‌زمان با الکتروفورز استفاده می‌شود. به این نوع ژل‌ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند. چنین ژل هایی پیچ و تاب‌های اسیدهای نوکلئیک را از هم باز کرده و تفکیک مولکول‌ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می‌شود. در این ژل‌ها مولکول‌های کوچک ‌تر در مقایسه با مولکول‌های بزرگ ‌تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند.

 انواع الکتروفورز

1- الکتروفورز کافی آند این دستگاه از جنس گرافیت است. همین ویژگی سبب کاهش چشمگیر قیمت آن شده است. 2- الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار چنانچه اشاره شد، هر چه غلظت ژل کمتر باشد با آن می توان مولکول های بزرگتری را بوسیله الکتروفورز، تفکیک کرد. ولی در این رقت محدودیت وجود دارد به طوری که حتی با رقیق ترین ژل های آگارز هم نمی توان مولکول های DNA بزرگتر از 100 کیلو جفت باز را تفکیک کرد. برای این منظور از روش های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار استفاده می شودکه دارای انواع مختلفی است:

  • الکتروفورز در مقدان الکتریکی ضربان دار تک جهتی
  • الکتروفورز در میدان الکتریکی معکوس
  • الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار با ژل پلی اکریل آمید

3- الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار تک جهتی (UPFGE) یکی از ساده ترین روش های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار، روش UPFGE می باشد. برای این روش از یک دستگاه ژل الکتروفورز افقی معمولی استفاده می شود. در UPFGE، میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین قطع شده و دوباره برقرار می شود. هنگامی که میدان برقرار است مولکول DNA بصورت گسترده درآمده و در جهت میدان حرکت می کند. با قطع شدن جریان الکتریکی، حرکت DNA متوقف شده و DNA فرصت می یابد تا به حالت هیئت فضایی خاص خود در آید ولی با برقراری مجدد جریان حرکت مولکول آغاز می شود. در زمانی که میدان الکتریکی برقرار نیست همه مولکول ها فرصت نمی کنند بطور کامل به شکل فضایی خود در آیند هر چه مولکول کوچک تر باشد سریع تر می تواند به شکل فضایی خود درآید و از آن خارج شود. براین اساس می توان مولکولهای نسبتاً بزرگ را از هم تفکیک کرد. با استفاده UPFGE می توان مولکول هایی تا اندازه 400 کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد. از این روش الکتروفورزی در آنالیز ژن های بزرگ نظیر ژن کد کننده پروتئین دیستروفین که در پیدایش بیماری دیستروفی عضلانی نقش دارد، استفاده می شود. 4- الکتروفورز در میدان الکتریکی معکوس (FIGE) در روش FIGE، جهت میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین ، معکوس می شود در این روش برای تفکیک مولکول های کوچک از دامنه های زمانی کم استفاده می شود. یعنی میدان الکتریکی بطور متناوب به مدت 5/  ثانیه در جهت مستقیم و به مدت 25/  ثانیه در جهت مخالف برقرار می شود. در مورد مولکول های بزرگ تر از زمانهای بیشتر، 3 ثانیه به جلوو 1 ثانیه در جهت مخالف استفاده می شود. با این روش می توان مولکول هایی تا اندازه 800 کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد. 5- اکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار با ژل پلی اکریل آمید (PFGE) PFGE یکی از متداولترین روش های الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار است. در این روش از دو میدان الکتریکی که نسبت بهم بصورت عمود قرار گرفته اند، در فواصل زمانی معین بطور متناوب استفاده می شود. یکی از این میدان ها در جهت بالا به پائین و دیگری در جهت چپ به راست قرار دارد. مولکول های DNA پس از آنکه تحت تأثیر میدان اول حرکت کردند در اثر میدان دوم 90 درجه تغییر جهت داده و حرکت می کنند. در اثر این روش مولکول های DNA با یک حرکت چرخشی خود، در طول ژل بصورت زیگ زاگ حرکت می کنند. در روش PFGE می توان مولکول های بسیار بزرگی در اندازه بین 20 هزار تا 2 میلیون جفت باز را از از هم تفکیک کرد.

 الکتروفورز ژل

  1. الکتروفورز در ژل آگارز
  2. الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید
  3. الکتروفورز در ژل نشاسته
  4. الکتروفورز در ژلNative

1. الکتروفورز روی کاغذ در الکتروفورز کاغذی  نمونه به نقطه ای از نوار کاغذ فیلتر منتقل می شود. دو انتهای این نوار در منبع بافری قرار داده می شود و خود این نوار نیز با محلول بافر مرطوب می شود. با اعمال جریان مستقیم ذرات باردار نمونه با سرعت مشخصی به سمت الکترود های مخالف حرکت می کنند و این پدیده به جدا شدن باند ها که حاوی گروه های مشخصی از  نمونه ها هستند می انجامد. سرعت مهاجرت ذرات باردار در الکتروفورز کاغذی تابع بار هر ذره و به مقدار کمتر وابسته به برهم کنش آن با بستر ماتریکسی است . بعد از کامل شدن الکتروفورز که چند ساعت به طول می انجامد الکتروفورتو گرام ( Electrophoretogram) حاصله باید خشک شود و اجزای جدا شده ی نمونه (باند ها) به این ترتیب آشکار می شوند. 2. الکتروفورز روی استات سلولز الكتروفورز استات سلولز جهت بررسي هموگلوبينو پاتی ها: انواع مختلف حامل (Supporting media) وجود دارد که حامل های سلولزی از متداول ترین آنها می باشد. از مزایای آن می توان به سهولت استفاده، جدا سازی سریع هموگلوبین های A ، F ، S و C  (با جذب کم)، حمل آسان ونگهداری طولانی مدت با قرار دادن در کیسه پلاستیکی اشاره کرد و همچنین در مورد معایب می توان از عدم شناسایی اجزایی از هموگلوبین با غلظت کم، عدم جدا سازی همه انواع هموگلوبین بخصوص  هموگلوبین های ناپایدار.هم چنین هموگلوبین های  F و  A در کنار هم جدا می شوند که ممکن است مقادیر کم هر یک در برابر مقدار بالای دیگری قابل جدا سازی نباشند نام برد. 3. الکتروفورز مویین الکتروفورز مویین دارای انواع مختلفی می باشد. در بسیاری از موارد برای جداسازی یک گونه ی خاص می توان بیش از یک نوع را به کار گرفت. یکی از مزیت های اصلی الکتروفورز مویین این است که معمولاً با تغییر ترکیب الکترولیت به سادگی می توان تکنیک های مختلف را با استفاده از یک لوله ی مویین در آنالیزهای مختلف انجام داد. درحالی که در تکنیک HPLC برای تغییر نوع تکنیک اغلب به تغییر فاز متحرک و نیز تغییر ستون احتیاج است. الکتروفورز مویین

  • الکتروفورز مویین منطقه ای (CZE)

در این روش لوله ی مویین از یک نوع الکترولیت پر شده و سپس نمونه به درون آن تزریق می گردد و بار دیگر لوله ی مویین در ظرفی از همان الکترولیت قرار می گیرد. نمونه اغلب از سمت آند تزریق شده و با توجه به این که جریان الکترواسمزی به سمت کاتد می باشد، تمام اجزای تشکیل دهنده ی نمونه در یک جهت و به سمت کاتد مهاجرت خواهند کرد. در عین حال هر جز با توجه به تحرک الکتروفورتیک مربوط به خود با سرعت متفاوتی مهاجرت می نماید و در نهایت برآیند جریان الکترواسمزی و تحرک الکتروفورتیک اجزای تشکیل دهنده ی نمونه را به صورت باندهای مجزا، تفکیک می کند. ترتیب مهاجرت گونه ها براساس نسبت بار به اندازه می باشد. به این ترتیب که یون های کوچک تر و دارای بار بیشتر سریع تر از سایر یون ها مهاجرت می کنند. بیشترین سرعت مهاجرت مربوط به کاتیون های کوچک تر و دارای بار بیشتر و کمترین سرعت مهاجرت مربوط به آنیون های کوچک تر و دارای بار بیشتر می باشد. ذرات خنثی با سرعتی برابر با سرعت جریان الکترواسمزی مهاجرت کرده و بنابراین از یکدیگر جدا نخواهند شد. اگر قطبیت الکترودها برای تسریع آنالیز آنیون ها تعویض گردد، ترتیب خروج گونه ها بر عکس حالت ذکر شده در بالا خواهد شد.

  • کروماتوگرافی الکتروسینتیکی مایسلی (MEKC)

یکی از کاستی های عمده در CZE عدم توانایی این تکنیک در جداسازی گونه های خنثی از یکدیگر می باشد. با استفاده از تکنیک کروماتوگرافی الکتروسینتیکی مایسلی می توان این نقص را برطرف نموده و هم زمان ذرات خنثی و یون ها را جداسازی نمود. اساس این تکنیک بر پایه ی توزیع آنالیت بین دو فاز مایسلی و محلول الکترولیت استوار است. بنابراین می توان این تکنیک را نظیر HPLC در نظر گرفت. اگرچه در MEKC با بهره گیری از جریان الکترواسمزی امکان جداسازی های با کیفیت بیشتر فراهم می شود. مایسل را در این تکنیک می توان یک شبه فاز ساکن در نظر گرفت. تشکیل مایسل از طریق افزودن یک سورفاکتانت به الکترولیت زمینه در غلظتی بالاتر از غلظت بحرانی مایسل (CMC) انجام می شود. غلظت بحرانی مایسل به صورت کمترین غلظتی از سورفاکتانت که ایجاد مایسل نماید تعریف می شود. مولکول های سورفاکتانت دارای یک دنباله ی بلند آب گریز و سری باردار می باشند. یک مایسل تجمعی از مولکول های سورفکتانت به شکل کروی می باشد، به نحوی که دنباله های آب گریز به طرف مرکز کره و سرهای باردار به سمت بیرون (الکترولیت زمینه) جهت گیری کرده اند. جداسازی مواد بی بار به میزان توزیع این مواد بین مایسل ها و الکترولیت بستگی دارد. مواد بی بار آب دوست تمایلی به مایسل ها ندارند. به طور کلی بهترین جداسازی برای مواد بی باری که به نسبت های متفاوت بین مایسل ها و بافر توزیع شده اند، حاصل می گردد.

  • الکتروفورز ژل مویینه ای (CGE)

الکتروفورز ژل مویینه ای با استفاده از یک لوله ی مویین پر شده با ژل صورت می گیرد. متداولترین نوع ژل به کارگرفته شده در الکتروفورز پلی آکریل آمید می باشد. ژل دارای خلل و فرج هایی می باشد که امکان جداسازی گونه های باردار با اندازه ی متفاوت را از طریق مکانیزم غربال مولکولی فراهم می آورد. از آنجایی که اساس این نوع جداسازی بر پایه ی اندازه ی گونه ها می باشد، این روش برای گونه هایی با تحرک الکتروفورتیک یکسان و با اندازه ی متفاوت (گونه هایی که نسبت بار به اندازه ی یکسان دارند)، مناسب است.

  • ایزوتاکوفورز مویین (CITP)

اگرچه این نوع از الکتروفورز در واقع اولین نوع تجاری قابل دسترس محسوب می شود اما امروزه به ندرت به کار گرفته می شود. زیرا این روش قادر به جداسازی کاتیون ها و آنیون ها، هم زمان در یک آنالیز نمی باشد. در این روش از یک سیستم بافری غیرهمگن استفاده می گردد که متشکل از یک بافر جلودار(حاوی یون هایی با تحرک بیشتر از یونهای آنالیت) ویک بافر پایان رسان (حاوی یون هایی با تحرک کمتر از یون های آنالیت) می باشد. در این روش نمونه مابین بافر جلودار و بافر پایان رسان تزریق می گردد. با اعمال پتانسیل یون های آنالیت همانند CZE با سرعت متفاوت شروع به مهاجرت کرده و نوارهایی از یون های آنالیت ایجاد می گردد. با این تفاوت که در اینجا نوارهای آنالیت به هم چسبیده اند و مانند CZE با نوارهای بافری از هم جدا نشده اند. شکل داده ی خروجی در این روش بسیار متفاوت از سایر روش ها می باشد. داده ی خروجی که اصطلاحاً ایزوتاکوفروگرام نامیده می شود متشکل از پله هایی با طول متفاوت می باشد که طول هر یک متناسب با غلظت گونه ی مربوطه در آنالیت می‌باشد.

  • الکتروکروماتوگرافی مویین (CEC)

در این تکنیک لوله ی مویین با استفاده از یک فاز ساکن کروماتوگرافی پر شده است و اساس جداسازی بر پایه ی توزیع گونه ها بین فاز متحرک و فاز ساکن استوار است. این تکنیک ترکیبی از الکتروفورز و HPLC می باشد. لذا دارای مزایای هر دو روش است که از جمله ی آن ها می توان به صاف بودن نیمرخ جریان که منجر به کارایی بالاتر جداسازی میگردد، اشاره کرد. به علاوه همانند HPLC در این روش امکان جداسازی گونه های بدون بار وجود دارد.

الکتروفورز دو بعدی

در الکتروفورز دو بعدی ابتدا بعد اول ران می شود و سپس به صورت عمود بر بعد اول مولکول ها در بعد دوم ران می شوند تا یک الکتروفورگرام در بعد دوم شکل بگیرد. در بعد اول الکتروفورز، پروتئین ها بر اساس نقطه ایزوالکتریکشان به صورت خطی جدا می شوند. در بعد دوم، مولکول ها با 90 درجه تفاوت نسبت به بعد اول بر اساس وزن مولکولیشان جدا می شوند. از انجایی که دو مولکول به احتمال بسیار بسیار پایین در این دو ویژگی (نقطه ایزوالکتریک و وزن مولکولی) مشابه می باشند، مولکول ها با کیفیت بسیار بالاتری در الکتروفورز دو بعدی نسبت به الکتروفورز 1 بعدی جدا می شوند.

الکتروفورز دو بعدی
الکتروفورز دو بعدی

الکتروفورز پروتئین سرم (SPEP)

الکتروفورز سرم پروتئین یک تکنیک آزمایشگاهی جهت بررسی پروتئین های خونی می باشد. بیماری هایی همچون مولتیپل مایلوما، درد نامفهوم استخوان، پروتئین اوری، هیپر کلسیمی و انواع آنمی را می توان با استفاده از این تکنیک بررسی نمود . معمولا خون را ابتدا در یک سرنگ جمع می کنند و سپس بر روی یک غشای استاتی خیس خورده در بافر الکتروفورز می نمایند. پروتئین های سرم به پنج قسمت عمده تقسیم می شوند:‌ آلبومین سرمی، آلفا -1 گلوبولین ها، آلفا -2 گلوبولین ها، بتا-1 و بتا-2 گلوبولین ها و گاماگلوبولین ها. در این نوع الکتروفورز پروتئین ها در وسط صفحه بارگزاری می شوند و بر اساس بار خالص خود به سمت قطب مثبت و یا قطب منفی حرکت می کنند. آلبومین دارای بیشترین بار منفی است و بنابراین بیشترین حرکت را به سمت قطب مثبت خواهد داشت. جریان اندواسموتیک حرکت مایع به سمت کاتد می باشد که باعث می شود پروتئین های با بار ضعیف تر نیز حرکت کنند.

الکتروفورز پروتئین سرم (SPEP)
الکتروفورز پروتئین سرم (SPEP)

اصول تکنیک الکتروفورز ( DGGE)

دستگاه ژل الکتروفورز شیب غلظتی دناتورانت (DGGE) قادراست بر اساس اختلاف در حد تک جفت باز به جداسازی مولکول های DNA بپردازد. اساس کار این تکنیک، مد نظر قرار دادن تفاوت در میزان پایداری جفت بازهای GC (دارای سه پیوند هیدروژنی) با AT (حاوی دو پیوند هیدروژنی) می باشد. در واقع با تغییر در قطعات DNA و تبدیل بازهای at به GC موجب تغییر در پایداری مولکول خواهد شد که همین اختلاف عاملی برای  شناسایی قطعات مختلف می باشد. به منظور بررسی این جهش ها از تفاوت در نقطه ذوب استفاده می شود. برای این هدف، یک شیب افزاینده از مولکول های دناتوره کننده اوره و فرمامید که به صورت خطی در ژل اکریل آمید افزایش می یابند استفاده می شود. پاین افزایش در غلظت دناتورانت به همراه دمای اعمال شده به محیط (بین 50-70) موجب ذوب شدن نواحی مختلف DNA به صورت جدا گانه می گردد. در ناحیه خاصی از غلظت دناتورانت مولکول جهش یافته با نوع وحشی خود دارای تفاوت خواهد بود که یکی به صورت جزیی ذوب شده ودیگر ذوب نشده است. مولکول هایی که به صورت جزیی ذوب می شوند قابلیت عبور از میان منافذ ژل را کمتر دارا می باشند و با سرعت کمتری بر روی ژل حرکت می کنند. همین امر موجب جدایی و متعاقبا شناسایی آنها می گردد.

نتیجه

به سبب اینکه ماکرومولکول های زیستی مانند DNA و پروتئین ها باردار هستند می توان با قرار دادن آن ها در یک میدان الکتریکی، آن ها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بارالکتریکی تفکیک کرد. برای این منظور از روشی به نام الکتروفورز استفاده می شود. روش های مختلفی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسیدهای نوکلئیک یا پروتئن ها ابداع شده است‌.

اصطلاحات

  • باند ژل الکتروفورز: هر باند نشان دهنده یک مولکول DNA خاص می باشد که دارای وزن مولکولی ویژه می باشد.
  • Ladder: به منظور تشخیص وزن مولکول های جداشده معمولا مارکرهای وزنی معینی وجود دارند که همگام با ران نمودن نمونه ها ران می گردند. این مارکر که به Ladder نیز معروف می باشند، حاوی مخلوطی از مولکول های دارای وزن مشخص می باشند. معمولا نکته­ های که در مورد ladderها ضروری می باشد، این است که متناسب با جمعیت مولکولی که قرار است جدا شود، ladder را انتخاب نمود. این ladder باید حاوی مارکرهای دارای وزن کمتر و نیز بیشتر از مولکولی هدفی که قرار است جدا گردد، باشند. فاصله هایی که یک باند طی می نماید متناسب است با لگاریتم اندازه مولکول.
  • مارکرDNA: مارکر DNA جهت نشان دادن وزن مولکولی باندهای جدا شده. این مارکر دارای 11 باند مشخص می باشد که دارای توالی های بین 100 تا 1200 جهت باز می باشد.

گردآوری: مولود کاظمی منابع:

  1. https://blog.faradars.org/%D8%A7%D9%84%DA%A9%D8%AA%D8%B1%D9%88%D9%81%D9%88%D8%B1%D8%B2/
  2. https://www.geniranlab.ir/%D8%A2%D8%B4%D9%86%D8%A7%DB%8C%DB%8C-%D8%A8%D8%A7-%D8%A7%D9%84%DA%A9%D8%AA%D8%B1%D9%88%D9%81%D9%88%D8%B1%D8%B2
  3. http://www.zistfara.com/catalog_item/id,395/%D8%A7%D9%84%DA%A9%D8%AA%D8%B1%D9%88%D9%81%D9%88%D8%B1%D8%B2-%D9%87%D9%85%D9%88%DA%AF%D9%84%D9%88%D8%A8%DB%8C%D9%86-%7C-%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%A7%D8%AA-%D8%B3%D9%84%D9%88%D9%84%D8%B2.html
  4. http://labgozaresh.blogfa.com/post/3
  5. http://azista.blogfa.com/post/71
  6. http://fnm.ir/education/fnm_edu_CE_CE-types.htm
  7. http://bio1.ir/laboratory-techniques/electrophoresis1/197-2-de.html
  8. http://bio1.ir/laboratory-techniques/electrophoresis1/196-dgge.html
  9. https://fa.m.wikipedia.org/wiki
  10. https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j&url=http://eprints.qums.ac.ir/206/1/Hossein%2520Piri_Electrophoresis.pdf&ved=2ahUKEwjakqemgtTqAhURqxoKHecoDvUQFjAIegQIBBAB&usg=AOvVaw1VrpOPVRGh6BaL16HmR_t7
  11. http://www.zistfara.com/catalog_item/id,451/%D8%A7%D9%86%D9%88%D8%A7%D8%B9-%D8%A7%D9%84%DA%A9%D8%AA%D8%B1%D9%88%D9%81%D9%88%D8%B1%D8%B2-%7C-%D9%85%D8%B1%D8%A7%D8%AD%D9%84-%D8%A7%D9%86%D8%AC%D8%A7%D9%85-%D8%A7%D9%84%DA%A9%D8%AA%D8%B1%D9%88%D9%81%D9%88%D8%B1%D8%B2-%7C-%D8%AA%D9%81%D8%A7%D9%88%D8%AA-%D8%A7%D9%84%DA%A9%D8%AA%D8%B1%D9%88%D9%81%D9%88%D8%B1%D8%B2-%D8%A7%D9%81%D9%82%DB%8C-%D9%88-%D8%B9%D9%85%D9%88%D8%AF%DB%8C.html

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا