باکتری

توضیح تکنیک PCR کلنی و نکات مربوط به آن

PCR کلنی یک روش سریع برای تعیین حضور یا عدم حضور DNA درج شده در پلاسمید به طور مستقیم از سایر کلنی­ های باکتریایی است. کلونینگ مولکولی یکی از محبوب­ترین روش­ها برای انتقال DNA است. با این حال ، برای تعیین وجود یا عدم وجود DNA باید آزمایش­های مختلفی را انجام دهیم.

PCR کلنی روشی جدید است که در آن با آغازگرهای اختصاصی DNA درج شده، می توان تشخیص داد که آیا DNA مورد نظر ما به پلاسمید وارد شده است یا نه .در این مقاله، ما به ویژگی­ ها Colony PCR ، مزایا و محدودیت­ های آن می پردازیم .در ابتدا لازم است که با چند مفهوم و اصطلاح مختلف آشنا بشویم.

پلاسمید چیست؟

“پلاسمید DNA حلقوی باکتریایی است که به طور مستقل از کروموزوم باکتریایی تکثیر می شود و در دستکاری و انتقال ژن مورد استفاده قرار می گیرد.”

شبیه سازی ژنتیکی یک ابزار ژنتیکی مولکولی است که از مدت­ ها قبل در آزمایشگاه­ ها استفاده می­شد. به طور خلاصه، در شبیه سازی ژن، ژن مورد نظر خودمان را به روش مصنوعی در پلاسمید وارد می­ کنیم. این DNA به طور مستقل از کروموزوم باکتریایی تکثیر می شود. از پلاسمید ها در واقع برای تولید نسخه­ های زیادی از بخش­ های کوتاه DNA استفاده می­ کنند. از آنجا که باکتری­ها سریع­ تر از سایر ارگانیسم­ های دیگر تکثیر می­ شوند ، می­توانیم با وارد کردن DNA دلخواه در پلاسمید باکتریایی، نسخه های زیادی از ژن مورد نظر خود تولید کنیم.

پلاسمید F ، پلاسمید کول، پلاسمید تجزیه­ کننده و پلاسمید مقاومتی چندین نوع رایج از پلاسمیدها هستند که در باکتری یافت می­شوند. علاوه بر این، پلاسمید می­تواند به عنوان حامل مولکولی کار کند که بخش­های کوتاه DNA را از یک سلول به سلول دیگر منتقل می­کند.

به غیر از باکتری­ها، چندین پروکاریوت دیگر نیز حاوی DNA پلاسمید هستند. کار اصلی پلاسمید در باکتری­ ها زنده ماندن آنها در شرایط سخت است. از آنجا که پلاسمید ژن مورد نظر ما را منتقل می­ کند برای ما دانستن اینکه ژن مورد نظر به پلاسمید منتقل شده است یا نه بسیار مهم است.

 PCR کلنی چیست؟

PCR کلنی اصلاح PCR معمولی است که در آن کلنی­ های باکتریایی بطور مستقیم به عنوان الگوی PCR مورد استفاده قرار می­گیرند.

DNA پلاسمیدی که حاوی DNA مورد نظر ما است در شرایط وابسته به دمای تناوبی تکثیر می­شود.

اصل کلنی PCR:

کلونی باکتری ای که شامل پلاسمید است، مستقیما” از دو دسته پرایمر برای ثکثیر استفاده میکند. دسته اول insert-specific پرایمر‌ ها هستن که برای تکثیر توالی در نقطه‌ ی الحاق استفاده می­شوند و‌ دسته دوم vector-specific پرایمر ها هستن که برای تکثیر قطعه الحاق شده از آنها استفاده می­شود. (در نواحی کناری دو طرف نقطه الحاق)

 

پروتکل PCR کلنی:

PCR کلنی یکی از اصلاحات عالی PCR معمولی است. به جای DNA الگو، مستعمرات باکتریایی مستقیماً به واکنش اضافه می شوند. علاوه بر این، Taq DNA پلیمراز، آغازگرها، بافر واکنش PCR و DD / W در واکنش PCR نیز اضافه می­شود.

در اینجا در کلنی PCR ، انتخاب پرایمرها بسیار مهم است. همچنین، انتخاب آغازگرها به هدف آزمایش ما بستگی دارد. چه نوع اطلاعاتی را از آزمایش PCR کلونی خود می خواهیم؟

۱-اطلاعات مربوط به حضور یا عدم حضور DNA مورد نظر.

۲-اطلاعات مربوط به اندازه DNA مورد نظر.

۳-اطلاعات در مورد جهت DNA مورد نظر.

بسته به این که آغازگرهای مختلف برای PCR کلنی طراحی شده ­اند.

آغازگرهای خاص درج به محل خاص در هر دو طرف DNA درج شده مورد نظر ما متصل می­شوند. اگر به درستی به پلاسمید منتقل شود، این آغازگرها می­توانند به آن متصل شوند، در غیر این صورت قادر به اتصال نیست. این مجموعه آغازگر اطلاعات مربوط به وجود یا عدم وجود درج را فراهم می کند.

روش انجام

کلنی PCR نیازی به استخراج DNA ندارد. ما در اینجا استخراج DNA نمی کنیم. در عوض، چندین روش دیگر برای افزایش حساسیت واکنش استفاده می­شود.

چرا ما DNA پلاسمید را استخراج نمی کنیم؟ از آنجا که دلیل آن ساده است، غشای سلولی سلول باکتری بسیار صاف است. انواع مختلفی از روش­های استخراج DNA باکتری حاوی غشای سلولی نرم است که با گرم کردن یا سانتریفیوژ کردن آن با سرعت بالا به راحتی لیز می شود. همچنین، ما به DNA خود باکتریایی احتیاج نداریم. پلاسمید حلقوی در داخل سیتوپلاسم باکتری وجود دارد، بنابراین مراحل اضافی تصفیه نیز لازم نیست. با پارگی غشای سلول، DNA الگوی ما برای تقویت آماده است .با کمک جمع کننده استریل، چندین کلونی باکتریایی را انتخاب کرده و آن را به لوله Eppendorf منتقل کنید. حالا بافر TE را در آن بیفزایید و خوب مخلوط کنید. می توانید از D / W نیز استفاده کنید.

نمونه را ۲۰ دقیقه در حمام آب جوش گرم کنید.

به آرامی آن را محکم کنید.

نمونه را با سرعت بالا به مدت ۲ دقیقه سانتریفیوژ کنید.

 مایع رویی را به لوله دیگری منتقل کرده و از آن به عنوان یک الگوی DNA استفاده کنید.یک نمونه ۲۰ μL به واکنش اضافه می شود.

 

چرا رویی و گلوله نیست؟

 DNA یک زیست مولکول است. DNA پلاسمید حتی از DNA هسته ­ای باکتریایی کوچکتر است و فقط شامل چندین ژن تا ۱۰۰۰bp  تا ۲۰،۰۰۰ bp است .از این رو تنها با سانتریفیوژ کردن آن، DNA پلاسمید سبک­تر از سلول بیرون می­آید و در رویی قرار می­گیرد در حالی که گلوله حاوی پروتئین و DNA هسته ­ای است بنابراین ما از آن استفاده نمی کنیم. پلاسمید ما برای تکثیر آماده است.

 

 در روش دیگر، به طور مستقیم از کلنی باکتری استفاده کنید .این روش ترکیبی از Hot start PCR و کلنی PCR است. کلنی­های باکتریایی برداشت شده و به لوله واکنش PCR اضافه می شوند .لوله ها درون دستگاه PCR قرار می گیرند. یک مرحله گرمایش اضافی اضافه می شود. با گرم کردن آن به مدت ۵ تا ۷ دقیقه  DNA  پلاسمید از سلول بیرون می آید. اکنون آغازگرهای مخصوص DNA ای را که وارد کرده ایم تقویت می کنند. و آغازگرهای پایدار بقیه DNA را تقویت می کنند. تقویت برای ۲۰ تا ۲۵ چرخه انجام می­شود. شرایط چرخه برای PCR کلنی در زیر ذکر شده است :

نکاتی برای بهبود شیوه کار:

– فقط از چند کلنی استفاده کنید، زیرا بسیاری از کلنی­ ها احتمال اتصال غیر اختصاصی را افزایش می دهند.

– از کنترل مثبت و کنترل منفی استفاده کنید.

– همانطور که یک کنترل مثبت از آغازگر پهلو استفاده می­کرد حتی اگر درج حضور نداشته باشد، واکنش PCR باند DNA از DNA پلاسمید را نشان می­دهد که نشان می­دهد واکنش ما آماده شده صحیح است.

– به عنوان یک کنترل منفی، از پلاسمید غیر ترانسفورم پلاسمید بدون درج DNA استفاده کنید، این DNA پلاسمیدی تنها در صورت وجود درج تقویت می­شود.

– به عنوان یک درج از توالی DNA کوتاه استفاده می­کند، توالی­ های DNA طولانی­ تر احتمال ایجاد پیوندهای غیر اختصاصی و نارسایی واکنش PCR را افزایش می­دهند.

– علاوه بر این، از برنامه های PCR کوتاه­ تر استفاده کنید.

کاربرد اصلی کلنی PCR در شناسایی بستن صحیح و درج قرار دادن DNA در باکتری­ ها و همچنین پلاسمید مخمر است .پس از اتمام واکنش PCR کلنی، محصولات PCR روی ژل آگارز ۲٪ اجرا می شوند. نتایج آزمایش در شکل زیر نشان داده شده است :

مزایای استفاده از PCR کلنی:

۱- این روش سریع و مقرون به صرفه است.

۲- علاوه بر این، دقت و ویژگی تکنیک بالاتر است.

۳- تنظیم درست مانند PCR معمولی ساده است، استخراج DNA و تصفیه پلاسمید مانند مراحل زحمت کش لازم نیست.

۴- برای شناسایی DNA درج نیازی به هضم محدود نیست.

۵- کل آزمایش را می توان طی ۹۰ دقیقه به پایان رساند.

 

 

معایب کلونی PCR:

این روش مقرون به صرفه، سریع و قابل اعتماد است، اما هیچ جهشی در داخل قابل شناسایی نیست.

علاوه بر این، اطلاعات توالی را نمی توان با PCR کلنی بدست آورد. برای تأیید تحول DNA باید ترتیب توالی را انجام دهیم .احتمال نتایج مثبت کاذب زیاد است.

Multiplex PCR چیست؟

پس از اتمام آزمایش، نمونه برای تعیین توالی ارسال می­شود که در آن می­توان توالی DNA مورد نظر ما را تعیین کرد. ما حتی می­توانیم از طریق ترکیب آغازگر های اختصاصی و آغازگر های مخصوص پلاسمید، PCR مالتی پلکس را انجام دهیم.

 

نتیجه:

اگرچه کلنی PCR بهترین انتخاب برای شناسایی انتقال ژن است، اما تنها تکنیک PCR کلنی برای تفسیر نتایج کافی نیست. ممکن است برخی از جهش­ های موجود در داخل، که توسط PCR قابل تشخیص نیستند .برای تأیید نتایج، توالی DNA لازم است. پس از تعیین ترتیب توالی می­توان گفت ژن مورد علاقه ما به درستی وارد شده است یا نه.

 

مترجم : راضیه شیرگیر

منبع: https://geneticeducation.co.in/what-is-colony-pcr/

0 پاسخ

دیدگاه خود را ثبت کنید

تمایل دارید در گفتگوها شرکت کنید؟
در گفتگو ها شرکت کنید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *