بیماری نیوکاسل

بیماری نیوکاسل

ایمنی ‌زایی یک آنتی‌ژن‌ ترکیبی مصنوعی جدید (هماگلوتینین-‌ نورآمینیداز) از ویروس بیماری نیوکاسل

توسط انتقال دهانی بذر های تراریخته کانولا به جوجه مرغ ها

اسامی:

محمد جواد معتمدی، محمد مجید ابراهیمی، شهلا شاهسوندی، جعفر امانی، روح الله کاظمی، مهیات جعفری،

علی- هاتف سلمانیان

Springer science+ Business Media , LLC, part of‌ Springer Nature 2020

 

چکیده :

بیماری نیوکاسل(ND) به‌عنوان یکی اززیان بار ‌‌‌ترین بیماری‌های عفونی پرندگان اهلی درنظرگرفته می‌شود و

تهدید قابل توجهی برای تولید طیور تجاری(پرورشی) است.دو گلیکو پروتئین سطح، هماگلوتینین – نورآفینیداز

(HN) واتصال دهنده(F) به عنوان آنتی ژن هایی در ساختار ویروس عمل می‌کنند وهمچنین نقش مهمی در

آلوده شدن سلول‌های میزبان دارند.در مطالعه ی حاضر بیان پروتئین کایمیریک HN-F در دانه های کلزا و ایمنی‌

زایی آن در جوجه‌ها بررسی شد.ژن  HN-Fدر پایین‌ دست پروموتر اسید چرب الانگاز(طویل ساز) ۱ (FAE1) در

برابر بیان دوتایی، PBI1400HN-F کلون شد، وبا استفاده از تغییرات با‌ واسطه‌یAgrobacterium  به کلزا

(Brassica napus L.) وارد شد.مقدارگلیکوپروتئینHN-F  به ترتیب تا۱۸‌/۰ و۱۱/۰ کل پروتئین محلول(TSP) دردانه

های تراریخته و برگ‌های کلزا تخمین زده شد. تجزیه وتحلیل تایید ۳۶ مورد تراریخته نشان داد که ژن HN-F  در

ژنوم ادغام شده است. پس ازآن، پروتئینHN-F  می‌تواند بیان شده و در بافت دانه انباشته شود.جوجه های

خاص بدون پاتوژن(SPF) که بصورت خوراکی با HN-F  نوترکیب ایمن سازی شدند، افزایش قابل توجهی در آنتی

بادی‌های مهار هماگلوتیناسیون خاص(HI)۳۵ تا۴۲ روزدر خون پس از اولین تجویزرا نشان دادند. نتایج حاکی از

پتانسیل بیان مبتنی بر دانه‌های کلزا تراریخته برای تحویل خوراکی گلیکوپروتئین‌های ایمنیNDV است‌.

کلمات کلیدی:

ویروس بیماری نیوکاسل، پروتئین مصنوعی  HN-F ، کانولای تراریخته با انتقال دهانی،

بیماری نیوکاسل (AND) درچندین کشورجهان شیوع دارد و به عنوان یک عامل عفونی زیان باردرصنعت طیور

محسوب می‌شود. ویروس بیماری نیوکاسل(NDV) متعلق به گونه پارامیکسوویروس پرندگان نوع۱(AMPV-1)

ازخانواده یParamyxoviridae   به ترتیب: Mononegavirales  است(۱).براساس پروتکل های سازمان جهانی

بهداشت وحیوانات(OLE)، عفونتNDVکه دارای شاخص بیماری زایی داخل مغزی(ICPI) 0.7یا بالاتر در مرغ‌های

یک روزه است، به عنوان یک بیماری قابل تشخیص تلقی می‌شود(۲).این ویروس حاوی یک مولکول RNA تک

رشته ای نوع منفی(sense-) است که دارای شش پروتئین ساختاری ازجمله: نوکلئوکپسید، فسفوپروتئین،

ماتریکس، همجوشی(اتصال دهنده)، هماگلوتینین- نورآمینیداز و پلی مراز را کد می‌کند(۳).

NDVs  ها در سه یا چند پاتوتیپ شامل: لنتوژنیک، مزوژنیک و ولوژنیک دسته بندی می‌شوند که به ترتیب کمترین،

متوسط وبیشترین سویه‌های بسیارویروس هستند.عوامل مختلفی که در حساسیت میزبان وژنوتیپ‌های ویروس

دخیل هستند می‌توانند باعث بروز عوارض و مرگ ومیر قابل توجهی در طیور شوند(۴)

واکسن های مورد استفاده :

ده‌ها سال است که عفونت‌هایNDV  توسط هردوواکسن‌های ضعیف وغیرفعال زنده کنترل می‌شوند. بیشتر

واکسن‌های زنده ویروس‌های لنتوژنیک هستند که معمولا در سراسرجهان استفاده می‌شوند. با این حال، 

ازسویه های مزوژنیک هنوز هم در برخی از کشور‌های آسیا و آفریقا به طور گسترده استفاده می‌شود(۵).

واکسن‌ها به طور گسترده در مناطقی که سویه‌های ولوژنیک در بین طیور توزیع می‌شود، مورد بهره‌ برداری قرار

می‌گیرند. به عنوان مثال، ویروس‌های لنتوژنیک به عنوان مثال،(Lasota ,B1(  وخشن(به عنوان مثال،VG / GA , V4  )

معمولا به عنوان واکسن برای کنترلND  درطیور استفاده می‌شوند(۶).در حال حاضر، واکسن های موجود ایمنی

زایی کافی در برابر سویه‌های بسیار پرخطرNDV  نمی‌کنند(۷).بنابراین پیشگیری وکنترل بهترND  مورد نیاز است

که می‌تواند با جداسازی ژن‌های ویروسی که در پاتوژنزنقش دارند، حاصل شود(۸).
گزارش‌های زیادی در مورد خانواده‌ی پارامیکسوویروس وجود دارد که بر نقش حیاتی گلیکوپروتئین‌های پاکت (پوشش)، هماگلوتینین- نورآمینیداز(HN) وهمجوشی(اتصال دهنده)(F)،  درپاتوژنز ویروسی(۹،۱۰)تاکید دارند.

پروتئینHN   ازNDV   یک تعیین کننده‌ی اصلی آنتی ژن است و همچنین عملکرد مهمی در بیماری‌زایی ویروسی

دارد(۱۱).این پروتئین غشایی پیوسته از حوزه‌های غشایی انتهاییN   مجاور یک منطقه ساقه یک سر کروی

انتهاییC  تشکیل شده است که به گیرنده‌های سلولی حاوی اسیدسیالیک متصل می‌شوند(۱۲)پروتئینF  

ادغام پاکت ویروسی و غشای سلول میزبان را تسهیل می‌کند و در نتیجه باعث تشکیل منافذ برای نفوذ ژنوم

ویروسی می‌شود(۱۳).

همجوشی غشایی :

همجوشی غشایی برای عفونت، مورد نیاز است و بنابراین پروتئینF  یکی از عناصر اصلی برای ایمنی است(۱۴).

دانه‌هایF شامل: یک پپتید همجوشی (اتصال دهنده) آبگریز است که به سلول‌های میزبان وارد می‌شود، یک

دامنه‌ی غشایی (TM(متصل به پاکت ویروسی، و تکرارهای متعدد هپتاد شامل: HR-T (مجاورپپتید همجوشی)

و HR-B(نزدیک دامنه‌یTM) می باشند (۱۵).

هزینه‌های بالا و چالش‌های فنی واکسن،تجویز در مقیاس وسیع، مشکلات عمده‌ی واکسن‌های متداول(عمدتا

ضعیف و غیر فعال زنده) علیهNDV  است.علاوه براین، این واکسن‌ها ممکن است منجر به ظهور ویروس خطرناک

در نتیجه‌ی ترکیب مجدد در مناطق کدگذاری و بدون کدگذاری ژنومNDV  شوند(۱۶).بنابراین، تولید واکسن‌های

جدید با خطر کمتر و اثرات سوء‌ کمترباید مورد توجه قرارگیرد.ازسیستم های مختلف برای بیانHN   ویا پروتئینF 

به عنوان واکسن‌های زیر مجموعه ای علیهNDV   استفاده شده است.

اخیراً برخی از تلاش‌های موفقیت‌ آمیز دراشرشیاکلی(۱۷)،ساکارومایسس سرویزیه(۱۸)، لاکتوباسیلوس پلانتاروم

(۱۹)Pichia pastoris ، (۲۰) Baculovirus ،(۲۱) گزارش شده است.

با توجه به گیاهانی که دارای مزایای مختلفی از جمله تولید درمقیاس وسیع، هزینه‌ی کم، ایمنی و الگوی ویرایش

صحیح پس از ترجمه هستند، توجه زیادی به گیاهان تراریخته به عنوان بستری مناسب برای بیان ایمونوژن‌های

NDV  به عنوان واکسن‌های نوترکیب شده است(۲۷-۲۲) در این راستا، توسعه‌ی سیستم‌های گیاهی به عنوان

ابزاری قدرتمند برای تولید واکسن‌های زیر مجموعه ای ویروسی می‌تواند امکان جایگزینی واکسن‌های خوراکی

با واکسن‌های دیگر را فراهم کند(۲۸). ثابت شده است که می‌توان از دانه‌های خشک به عنوان وسیله‌ای برای

انتقال واکسن خوراکی استفاده کرد(۲۹).

بذر Canola ظرفیت قابل توجهی برای تولید مولکولی دارد زیرا پروتئین‌های نوترکیب می‌توانند جمع شده و مراحل

استخراج و تصفیه را تسهیل کنند.عوامل مختلفی از جمله توزیع در سراسر جهان، سهولت تغییر شکل وبازسازی،

عملکرد زیاد دانه‌ها و پروتئین نسبتاً زیاد محتوای دانه(۲۵٪) آن را به عنوان میزبان بیان مناسب ایجاد کرده است(۳۰).

یکی از راهکارهای افزایش تولید پروتئین هترولوگ در گیاهان،ایجاد پروموترهای موثر است(۴).

اسیدچرب الانگاز۱(FAE1):

اسیدچرب الانگاز۱(FAE1) ، یک آنزیم خاص دانه است که مقدار کل افزایش اسیدچرب در جنین را دستکاری می‌کند.

ثابت شده است که پروموترFAE1 بسیار فعال است و می‌تواند بیان ژن‌های هترولوگ را دردانه های بالغ Arabidopsis

(۳۱) وB.napus (۳۲،۳۳) تنظیم کند. درمطالعه ی حاضر، ژن چند مولکولیHN-F ازNDV  با رویکردهای بیوانفورماتیک

(۳۴) مورد تجزیه وتحلیل قرارگرفت و برای تولید کلزای تراریخته از طریق روش تحول با واسطهAgrobacterium

tumefaciens   استفاده شد.اثر ایمنی زایی خوراکی پروتئینHN-F  نوترکیب با انجام آزمایش‌های ELISA   و مهار هماگلوتیناسیون ‌(HI) در جوجه های خاص بدون پاتوژن(SPF) بررسی شد. نتایج نشان داد که پروتئین کالیمریک HN-F

می‌تواند بیان و در دانه‌های کلزا تراریخته تجمع یافته و آنتی بادی ضدNDV  خاص آن‌را به عنوان یک ایمونوژن کمی قوی

در مرغ‌ها تشخیص دهد. از نظر دانش ما، این اولین گزارش استفاده از دانه‌های کلزا تراریخته به عنوان بیوراکتور برای

تولید گلیکوپروتئین‌های NDV   برای ایمن سازی خوراکی مرغ به عنوان واکسن زیرواحد است.این می‌تواند افق

جدیدی ازکاربرد پروتئینHN-F  چند ظرفیتی در سایر گیاهان با ارزش مانند: ذرت به عنوان تغذیه‌ی اصلی رژیم غذایی

مرغ فراهم کند.

مواد  ها و روش ها :

ساخت ناقلین بیان گیاهان

قبلاً طراحی ساختاری بیان گیاه HN-F گزارش شده بود.  به طور خلاصه ، مناطق HRA و HRB (269 aa) از پروتئین

F و مناطق اپیتوپیک پروتئین HN از جمله دامنه های سر و ساقه (۳۱۵aa)انتخاب و با استفاده از یک اتصال دهنده

پپتید-مارپیچ شکل به هم متصل شدند. سپس ، توالی بهینه شده کدون کلزا برای ژن مصنوعی HN-F (شماره

الحاق JX442483 ا) استفاده شد. برای افزایش کارایی شروع ترجمه در ژن مصنوعی ، از توالی اصلاح شده ozakk

برای گیاهان (AAA ACAAUG G+4C+5) در موقعیت های جانبی کدون شروع ترجمه استفاده شد. علاوه بر این ،

توالی KDEL در انتهای ۳ʹ ژن مصنوعی HN-F برای احتباس پروتئین نوترکیب در شبکه آندوپلاسمی (ER  )الحاق

شد. یک DNA مصنوعی ۱۹۷۷ جفت باز کد کننده ژن Chimeric HN-F با آنزیم های مناسب از pUC57 هضم شد.

پلاسمید و به ترتیب در نواحی  Xbal / Sacl از pBI121 (شرکتClontech  )و Cfr9I / Sacl از وکتورهای بیان pBI1400

زیر کلون شدند.

در پلازمید pBI1400 ، پروموتر گل کلم موزاییک ویروس ۳۵S (CaMV35)در وکتور دوگانه pBI121 با پروموتر FAE

مخصوص بذر (۱۴۰۰ جفت باز) از ژن B. napus FAE1 جایگزین شد. حضور ژن HN-F در پلاسمیدهای نوترکیب با

PCR ، هضم و در نهایت با تعیین توالی تأیید شد (داده ها نشان داده نمی شوند). پلاسمیدهای حاصل pBI121-HN-F

و pBI1400-HN-F با استفاده از روش انجماد-ذوب به A. tumefaciens (LBA4404)منتقل شدند

تولید گیاهان کلزا تراریخته

دانه های بالغ B. napus cv. PF-7045–۹۱ (از موسسه اصلاح بذر و گیاهان ، کرج ، ایران) با غوطه وری در NaClO

۱٫۵٪ (وزنی / وزنی) حاوی ۰٫۱٪ تریتون X-100 به مدت ۱۰ دقیقه ضدعفونی شد ، پنج بار با آب استریل شست

وشو و در محیط موراشیگه و اسکوگ (MS) رشد داده شد.برگ های لپه گیاهان ۵ روزه به مدت ۵ دقیقه در

سوسپانسیون A. tumefaciens غوطه ور شد. ریزنمونه ها با A. tumefaciens که محل pBI12-HN-F و pBI1400-HN-F

است در مدت زمان ۴۸ ساعت در ۲۴ درجه سانتی گراد در تاریکی و محیط کشت MS کشت داده شد. این ریزنمونه

ها به محیط انتخابی همراه با ۴ میلی گرم در لیتر ۶-بنزیلامینوپورین (BAP )، ۲۰۰ میلی گرم در لیتر سفوتاکسیم و

۱۰ میلی گرم در لیتر کانامایسین در یک فیتوترون تحت دوره زمانی ۱۶/۸ ساعت روشن / تاریک منتقل شدند.

گیاهچه های ریشه دار به گلدان های پلاستیکی کوچک پیوند داده و تا زمان رسیدن بذر در گلخانه پرورش داده شدند.

استخراج DNA و تجزیه و تحلیل PCR

DNA ژنومی کلزا از بافت برگ (۱ گرم) با روش CTAB همانطور که شرح داده شد استخراج شد و حدود ۱۰۰ نانوگرم

DNA به عنوان الگویی برای تجزیه و تحلیل PCR استفاده شد. برای تقویت ژن HN-F ، تجزیه و تحلیل PCR مفروض

توسط پرایمر اختصاصی پیشرو (۵ʹ-AAA ACA ATG GCT AAAAAC ATC TCC ATC-3ʹ)  و معکوس (۵ʹ-TCA GAG TTC

GTCTTT ATG ATG GTG G-3ʹ) انجام شد. PCR تحت شرایط زیر انجام شد: دناتوراسیون اولیه در ۹۵ درجه سانتیگراد

به مدت ۵ دقیقه و سپس ۴۰ سیکل ذوب ۲۰ ثانیه در ۹۵ درجه سانتیگراد ، ۲۰ ثانیه حرارت دهی در ۶۲ درجه

سانتیگراد ، ۴۵ ثانیه در ۷۲ درجه سانتیگراد و یک مرحله نهایی انکوباسیون در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۵

دقیقه قرار می گیرد. از پلاسمید pBI1400-HN-F و DNA از گیاه غیر وحشی نوع کلزا به ترتیب به عنوان شاهد

مثبت و منفی استفاده شد. قطعه DNA تکثیر یافته بر روی الکتروفورز ژل آگارز ۱٪ بارگزاری شد و تحت نور ماورا

بنفش آنالیز شد.

 

 

تحلیل نورتن بلات

DNA ژنومی جدا شده از گیاهان نوع وحشی و تراریخته (۴۰ میکروگرم) به مدت یک شب در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد

تحت هضم SacI قرار گرفت ، بر روی الکتروفورز ژل آگارز ۱٪ جدا شد و توسط تکنیک نورتن بلات به N + نایلون

mem-Brane (Roche Co آلمان) بر اساس روشهای استاندارد منتقل شد. یک کاوشگر دارای برچسب دی آی جی

(۸۵۲ جفت باز) حاوی قطعه f با استفاده از ژن HN-F به عنوان الگو وپرایمراختصاصی با PCR DIG Labeling Mix

سنتز شد. پرایمر پیشرو ۵ʹ-AAA ACA ATG GCT AAA AAC ATC TCCATC-3ʹ و ۵ʹ-AGC TTT

AGC GGC TGC CTC CT-3ʹ پرایمر معکوس می باشد. انالیز و شناسایی با استفاده از کیت PCR DIG Detection

(روشه ، آلمان) انجام شد.

تهیه آنتی بادی های خاص علیه HN ‑ F نوترکیب

برای تهیه آنتی بادی های خاص ، دو پروتئین چند دومینی(چند بخشی) HN وF به صورت جداگانه در E. coli BL21-DE3

بیان شده و پروتئین های نوترکیب توسط ستون کرموتوگرافی Ni-NTA شرکت Qiagen خالص شدند. به موشهای ماده

BALB / c به صورت زیر جلدی ۱۵ میکروگرم از هر پروتئین نوترکیب HN و F با ادجوانت کامل فروند تزریق شد (سیگما

شرکت آلمان)   .ایمن سازی با دو دوز تقویت کننده ، هر ۱۰ میکروگرم از آنتی ژن های نوترکیب با ادجوانت ناقص فروند

(سیگما شرکت آلمان) در فاصله دو هفته تکرار می شود. PBS به همان روش کنترل منفی تزریق شد . سرم های

ایمنی پس از تزریق سوم از نمونه های خون تهیه شده و برای تجزیه و تحلیل ایمنی در دمای منفی۷۰ درجه سانتیگراد

منجمد نگه داشته شدند.

الیزا نیمه کمی

پروتئین های محلول کل (TSP) از دانه های رسیده و برگ های تازه (۵۰۰ میلی گرم) گیاه کلزا با همگن سازی در

نیتروژن مایع و افزودن بافر استخراج (۲۰۰ میلی مولار Tris – HCl ، pH 8.0 ، ۱۰۰ میلی مولار نمک طعام ، ۴۰۰ میلی

مولار ساکارز ، ۱۰ میلی مولار بدست آمد. EDTA ، ۱۵ میلی مولار ۲-مرکاپتواتانول ، ۱ میلی متر PMSF ، ۰٫۰۵ T توئین

-۲۰). پس از سانتریفیوژ (۱۰ دقیقه ، ۱۳۰۰۰ × گرم) ، TSP در رویی ها با استفاده از روش پروتئین بردفورد اندازه گیری

شد (بردفورد ، ۱۹۷۶).

صفحات Maxisorb (نونک ، دانمارک) با ۱۰ میکروگرم TSP در بافرخودکار (۶۴ میلی مولار Na2CO3 ، ۱۳۶ میلی مولار

NaHCO3 ،pH 9.8) پوشانده شده و یک شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد انکوبه شدند.  سپس میکروپلیت با ۳٪

(بدون وزنی) شیر بدون چربی در بافر PBS حاوی ۰٫۰۵٪ Tween-20 (PBST) غوطه ور شده و پس از آن سه بار با

PBST شسته شد. آنتی سرم های پلی کلونال در برابر rHN وrF  (۱:۱۰۰۰)رقیق شده با PBST به هر چاهک اضافه

شده و به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند.

پس از مرحله شستشو ، میکروپلیت به مدت ۹۰ دقیقه و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد با  HRP بز ضد موش متصل

به IgG (1:5000)سیگما شرکت آلمان انکوبه شد. محلول O-phenylenediamine (OPD) (Sigma Co. Germany)

به علاوه H2O2 مورد استفاده برای توسعه رنگ و واکنش با ۲٫۵ M H2SO4 انجام شد.  تیترهای چگالی نوری در

۴۹۲ نانومتر اندازه گیری شدند. سطح نسبی rHN-Fبیان شده در مواد گیاهی توسط مقایسه پسر OD های خالص

در ELISA بین گیاهان نوع وحشی و تراریخته مورد ارزیابی قرار گرفت و سپس بر اساس منحنی استاندارد که قبلا

با خالص سازی پروتئین های rHN و rF از E. coli BL21(DE3) با برچسب گذاری شده وی انجام شده بود. همه

نمونه های گیاه دو بار مورد بررسی قرار گرفتند و آزمون ANOVA با استفاده از نرم افزار SPSS 18.0 انجام شد.

وسترن بلات گیاهان تراریخته

تجزیه پروتئین rHN-F در گیاهان تراریخته به روش ایمنوبلات انجام شد. هسته از قسمت خطوط جنوبی مثبت در

نیتروژن مایع پودر شده و در دو حجم یکنواخت استخراج گردید.(۲۰۰ میلی مولار Tris-HCl ، PH 8، ۱۰۰ میلی مولار

NaCl، ۴۰۰ میلی مولار ساکارز، ۱۰ میلی مولار EDTA، ۱۵ میلی مولار مرکاپتو اتانول۲، ۱ میلی مولار PMSF، ۰۵/۰ % Tween 20).

مواد نامحلول به وسیله سانتریفیوژ جدا شد. (با دور ۱۳۰۰۰، ۱۰ دقیقه و دمای ۴ درجه سانتیگراد) و سوپرناتانت

( ۱۰۰میکروگرم از TSP) به اندازه همان مقدار ۱۰ درصد SDS-PAGE آزمایش بود.به وسیله ترانس بلات الکتروفورتیک

های کوچکِ (شرکت Bio-Rad آمریکا )، نوارهای پروتئینی محلول در غشای پلی ونیلی دین دی فلورئید (PVDF)،

شرکت Roach آلمان) در حضور بافر انتقال ( ۵۰ میلی مولار Tris پایه، ۴۰ میلی مولار گلیسین، ۰۴/۰ % SDS، متانول

۲۰ درصد، PH= 8/3) ترانسفر شدند.

برای جلوگیری از اتصال آنتی بادی غیر اختصاصی، با استفاده از ۵ درصد پودر شیر بدون چربی در TBS 5 دقیقه غوطه ورشد.برای تشخیص پروتئین کایمرک HN-F، غشا بوسیله آنتی سرم Anti-F و Anti-HN  با رقت ۱ به ۱۰۰۰، در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت یک و نیم ساعت انکوبه شد. بعد از سه بار شستشو غشا با انتی بادی دوم مورد آزمایش قرار گرفت. آنتی بادی IgG موش متصل به proxidase-conjugated (شرکت سیگما آلمان) به مدت یک ساعت در دمای ۳۷ درجه و رقت ۱ به ۵۰۰۰در نهایت این لکه در محلول ۳-۳دی آمینوبیزیدین (DAB) (شرکت سیگمای آلمان) و با دوبار شستشوی غشا بوسیله آب مقطر، متوقف گشت.

واکسیناسیون SPF خوراکی جوجه‌ها

در ابتدا دانه های کلزا که پروتئین rHN-F را بیان کرده، برای تجویز جوجه‌ها، آسیاب و مخلوط کرده و به صورت قطره چکانی

به جوجه ها خورانده می شود.این مخلوط شامل: ۴۷ درصد دانه ذرت، ۱۷٫۵ درصد دانه سویا، ۲۵ درصد دانه های کلزای تراریخته، ۵ درصد کلسیم کربنات، ۳ درصد سبوس برنج، ۱ درصد فسفات کلسیم، ۱ درصد شیره قند (ملاس)، ۱ درصد

سدیم کلرید، ۰٫۲ درصد متیانین، ۰٫۱ درصد ویتامین ها و ۰٫۱ درصد مکمل های طبیعی می باشد.برای ارزیابی ایمنی زایی

از طریق خوراکی جوجه های سفید Leghorn SPF 4 هفته ای، (واکسن خریداری شده از مرکز تحقیقات رازی، کرج، ایران) بصورت آزاد و آسیاب شده حاوی ۲٫۲۵ گرم دانه کلزای تراریخته شده تغذیه شدند. (۱۰۰ میلی گرم آنتی ژن rHN-F وزن

خالص دانه کلزا) به مدت ۲۸ روز متوالی نیز تغذیه شدند .حیوانات قبل از آزمایش در شرایط قرنطینه نگهداری می‌ شوند.

بیست و پنج جوجه س SPF به پنج گروه پنج تایی تقسیم شدند. از قبل از واکسیناسیون خوراکی جوجه ها به مدت ۱۲

ساعت  گرسنه هستند. گروه ۱ در فواصل هفتگی ۴ هفته با دانه های خرد شده HN-F تغذیه شدند. گروه ۲ همان شرایط

گروه ۱ را داشت، در حالی که پروتئین کایمریک خالص به طور زیر جلدی به جوجه تزریق می شد. (۵۰ میلی گرم rHN-F freund کمکی ناقص.) در هفته چهارم کنترل گروه ۳ به مدت ۴ هفته از طریق واکسن غیر تجاری B1 (هدیه از طرف موسسه تحقیقاتی رازی- کرج- ایران) از طریق چشم انجام شد. از گروه ۴ به صورت خوراکی با ۲۵/۲ گرم بذر کلزا غیر تراریخته به عنوان شاهد منفی استفاده شد. جوجه های گروه ۵ واکسینه نشده و به عنوان یک گروه طبیعی در نظر گرفته شدند.

تشخیص آنتی بادی  HIسرم توسط ELISA

حیوانات پس از هر بار تجویز نمونه برداری از خون می شوند. (۷ ، ۱۴، ۲۱ و ۲۸ روز) برای ارزیابی اختلال آنتی بادی ضد rh در سرم مرغ ،نمونه گیری اضافی (۳۵ ، ۴۲ و ۴۹ روز) برای هر پنج گروه ادامه یافت. از نمونه های خون (۱/۰ میلی لیتر در هر جوجه) برای ارزیابی آنتی بادی اختصاصی با خنثی سازی سرم و یک نمونه ELISA با استفاده از کیت الایزا تشخیص آنتی بادی NDV استفاده شد. (شرکت بیوچک آمریکا)

and horseradish peroxidase-conjugated rabbit anti chickens …

OD از نمونه های حیوانات درمان نشده از OD نمونه های آزمایشی و شاهد که مقدار جذب سه برابر است ، کم شد. تیترهای ELISA به عنوان مقادیر جذب بیان شدن بررسی شد.

 پروتئینHNFدردانه های کانولا

سه گیاه تراریخته(خطوط۱۹،۶،۳۱)نشان دادکه آنهابالاترین سطح پروتئینHNFرادارند،همانطورکه درتصور۲نشان داده شده

است آنهابیشتربرای تجزیه وتحلیل ایمنی عصاره پروتئین انتخاب شدند.پروتئین های محلول(۱۰۰میکروگرم) برروی SDS_PAGE10% بارگزاری شده وتحت آزمایش ایمونوبلات قرارگرفت،تجزیه وتحلیل باآنتی بادی های پلی کلونال HNF

خاص وجودپروتئین کایمریک راتاییدکرد.یک باندمشخص تقریبا۱۵کیلودالتون مربوط به گلیکوپروتئینHNFقادربه واکنش متقاطع

به هردوآنتی بادی پلی کلونال بود.درحالیکه هیچ باندی درتغییرشکل نشان داده نشده است،گیاهان ازنوع وحشی و

همچنین گیاهان تراریخته(تصویرa,b۳).rHNF تصفیه شده باکتری به عنوان شاهدمثبت تحت واکنش باهردوضدسرطان وضدHNوضدF استفاده شد.درخطوط تراریخته انتخاب شده،اندازه بیان شده پروتئین NDVFکمی بالاترازپروتئین معتبرHNF

بود(۶۹ کیلودالتون).

به منظورتعیین سطح بیان TSP،HNFازدانه های تراریخته استخراج وتحت آزمایش قرارگرفت.تست کمی الیزاکه درآن یک

منحنی برایrHNوrFبااستفاده ازمحدوده خطیpg۰۶/۰تارقت۱۲۵نانوگرم استاندارد اندازه گیری شده است.

براساس معادلهخط رگرسیون به ترتیب مقدارگلیکوپروتئین HNF تا۱۸/۰و۱۱/۰٪TSPدردانه های تراریخته وبرگ های کلزا تخمین زده شد.به عبارت دیگر،سطح بیان پروتئینHNFنوترکیب به طورمتوسط۵۵/۴۵میکروگرم درهرغلات رسیده است.

تصویر۲:

اندازه گیریHNFگلیکوپروتئین از۲۰بذرتراریخته کلزا ازنظرکمی تست الیزابرای ارزیابی خطوط مقدارHNFدرگیاه اندازه گیری شد، و از مقدارتست الیزانوع وحشی ازگیاه تراریخته کسرمی شودسپسODمنحنی استاندارد برآورد می شود.مقدارجذب anceمیانگین+-SD ازمقادیر چگالی نوردر۴۹۲نانومترازسه سنجش مستقل به دست آمده است.

تصویر۳:

آنالیزوسترن بلات ازپروتئینrHNFازعصاره های هسته ازسه خط تراریخته انتخاب شده(خطوط۱۹،۶،۳۱).یافته های بلات بااستفاده ازAیک سرم ضدHNوBیک سرم ضدFبه دست آمده ازموش هایی که باپروتئین های rHNوrFخالص شده به عنوان آنتی بادی اولیه تشخیص داده شد.خطC+,کنترل مثبت بااستفاده ازrHNF تصفیه شده باکتریایی،خطWT،گیاه نوع وحشی به عنوان کنترل منفی وخطM،نشانگروزن مولکولی

ایمنی زایی پروتئینHNFگیاهی درمرغ هایSPE

برای ارزیابی اینکه آیا پروتئینHNFگیاهی قادربه ایجادآنتی بادی هورمورال است،پنج گروه مرغ بااستراتژی های مختلف،ازجمله مسیر های خوراکی،تزریق خوراکی،قطره چشم ایمن سازی شدند.تیترزیادواختصاصی آنتی بادی های lgGعلیه پروتئینHNFنشان داد که مرغ های خوراکی دارای یک پاسخ ایمنی سیستمیک هستند.مقایسه میانگین مقادیردرنمونه های مختلف خون با روش دانکن

(P < 0.01)نشان دادکه گروه۴(مرغ هایی که ازبذرهای غیرتراریخته تغذیه می شوند)وگروه۵(مرغ هایی بدون هیچ
واکسیناسیون)هیچ تفاوت قابل توجهی بایکدیگرندارند.درروز۲۸،پاسخ آنتی بادی گروه۱(خوراکی)وگروه۲(تزریق خوراکی)تشخیص داده شدوبه تدریج درمرغ هایی که بادانه های کلزا تراریخته پروتئینHNF بیان شده واکسن تجاری تاروز۴۹پس ازایمنی سازی تغذیه شدند(تصویرA۴).تیتراسیون آنتی بادی سرم درگروه۱وگروه۲به ترتیب در۴۹و۳۵روزپس ازتجویزاول به حداکثرمیزان خودرسید،درحالیکه تیترگروه ایمن شده باواکسن تجاری(گروه۳)دراولین واکسیناسیون وسطح

بالای ضدنیوکاسلB1وlgGسرم نیزدرروز۳۵مشاهده شد.

همانطورکه درشکلB۴نشان داده شده است،میانگین هندسی

GMسرم تیترآنتی بادی می توانددرمرِغ هایی که باآن ایمن شده اندبه۳/۳برسددرمرغ های ایمن شده حاوی کلزاتراریخته

که بیان کنندهHNF_Pro_tein(گروه۱)و۶/۳درمرغ هایی که پروتئین دانه داردارندوبه دنبال آن تزریق زیرجلدی است(گروه۲).

درمرغ های باواکسن تجاری نیوکاسلB1ایمن سازی شده،میانگین هندسی تیتراسیون سرم(۴/۴)به طورقابل ملاحظه ای بالاترازمشاهدات درگروه۱وگروه۲بود(۰/۰۱>P)(شکلB۴)

تصویر۴:

تیترآنتی بادی ضدHNFدرمرغ های واکسینه شده باپروتئینHNFگیاهی توسط تست الیزا تعیین شده.خوراکی(بعدازچهارباربیان پروتئینHNFازبذرهای تراریخته)،تزریق خوراکی(پس ازسه باردانه تراریخته وپس ازتزریق۳۰میلی گرم پروتئینHNFبه صورت زیرجلدی)وکنترل(پس ازچهاربارایمن سازی)دانه های تبدیل شده.Aپاسخ آنتی بادیlgGهرمورال خاصHNFدرسرم درمقاطع مختلف زمانی اندازه گیری شد.Bتیترهای تست الیزا به عنوان میانگین هندسیGMدرمقیاسlog10ازبالاترین رقت سرم درگروه های مختلف مرغ بیان شد.نام گروه هابه ترتیب:۱.خوراکی،۲.تزریق خوراکی،۳.واکسن نیوکاسل،B1۴.بدون آنتی ژن،۵.عدم واکسیناسیون،بود.

مقادیر۴۹۲ODنانومتردرروش الیزاباایتفاده ازسه آزمایش مستقل ازروش دانکن به دست آمدوحروف مختلف نشان دهنده اختلافی معنی دارآماری در۰۱/۰>Pاست.خطوط عمودی نشان دهنده یSEمی باشد.

 

 

القای پاسخHIدرمرغ های ایمن سازی شده

برای تشخیص فعالیت آنتی بادی ها،آزمایشHIبرروی گلبول های قرمزمرغ بااستفاده ازسرم های ایمن سازی شده ازمرغ های SPEانجام می شود.نتایج آزمایشHIنشان دادکه گروه تزریق خوراکی۳۵روزپس ازایمن سازی قادربه تولیدبالاترین سطح تیتراسیون آنتی بادی(log2=7) درمقایسه باواکسن نیوکاسل(log2=9)B1بودند.

علاوه براین تیتراسیونHIگروه تغذیه خوراکی درروز۴۲به حداکثرمیزان خودرسیدlog2=5(تصویر۵).هیچ یک ازگروه های مرغ ایمن سازی شده در۲۸روزپس ازاولین واکسیناسیون میزان قابل توجهی ازآنتی بادیHIخاص رانشان ندادند.

همانطورکه درتصویر۵نشان داده شده است،سطح آنتی بادی هایHIدرگروه سوم واکسن تجاری وتزریق خوراکی در۴۲روز

هنوزهم درگروه خوراکی ایمن شده آنتی بادی های HI کمی بالاباقی مانده اند.

به نظرمی رسد گروه های خوراکی روندپایدارتری درتیترآنتی بادی به خصوص درروزهای۳۵و۴۲پس ازاولین واکسیناسیون درآزمایش های الیزاوHIنشان داده است. مشخص شده است که واکسیناسیون ازطریق تجویزخوراکی می تواندپاسخHIقابل توجهی همراه باتیترهای بالای آنتی بادی درآزمایش الیزادرمقایسه باشاهدمثبت ارائه دهد.

مباحثه:

توزیع سریع و عفونت انزوتیکی NDدر بسیاری از مناطق جهان هنوز به عنوان محدودیت عمده و تهدید بالقوه برای بهبود بهره وری در صنعت مرغداری در نظر گرفته شده است (۷) هزینه های بالا ودشوار واکسیناسیون در مقیاس بزرگ دو عیب در مسیرکاربرد گسترده واکسن های کلاسیک NDاست (۴)علاوه بر این، ما می دانیم که معمولا واکسن های زنده و غیر فعال شده برای ایجاد یک عفونت کنترل شده در برابر NDV در مرغ ها در نظر گرفته شده است.

هنوز، برخی از معایب مانند مقدار ویرولانس(بیماری زایی) ، پاسخ واکسیناسیون ناکافی، غیر فعال سازی و اجرای شدید کار ممکن است منجر به ارائه ی رویکرد جدید  برای افزایش اثربخشی واکسن های ND شود (۷) به طور کلی تزریق واکسن از طریق خوراکی به دلیل پاسخ ایمنی قابل اعتماد خطر کم و راه واکسیناسیون علیه NDVدر نظر گرفته می شود و کاهش نگرانی در مورد اثرات مضر آلودگی با عوامل بیماری زای مرغی به همراه دارند.(۴۱-۴۰)

گیاهان بهترین نمونه از پلتفورم های خوراکی هستند که فرصتی رابرای تولید مقیاس بزرگ و کم هزینه واکسن های چند واحدی فراهم می کنند و در نتیجه قادر به انجام اصلاحات پس از ترجمه پروتئین های یوکاریوتی پیچیده هستند.(۴۲)جمعیت

بذر ها دارای کیفیت ذاتی برای تولید و ذخیره پروتئین های آنتی ژنیک برای دوره های طولانی بدون پسرفت پیش از حد به

دلیل مقدار فعالیت پروتئولیتیک کم و رطوبت کم هستند که می تواند به عنوان یک یا چهار وعده غذایی با حداقل میزان خالص سازی تمام شود(۴۴-۴۳) دانه کلزا با مقدار پروتئین بالا(۱۹٫۶–۲۳٫۵% w/w) و ثمر زیاد دانه می تواند برای بهبود روند خالص سازی مورد بهره برداری قرار گیرد و همچنین میزان متوسطی از بیان پروتئین های هترولوگوس را به عنوان یک پلتفرم تحویل خوراکی انباشته می کند. (۴۵)

  تصویر ۵:

 تجزیه و تحلیل سرم مرغ های  SPFواکسینه شده rHN-F برای گروه های مختلف آزمایشی

در سه زمان مشخص پس از اولین واکسیناسیون توسط آزمونHI تعیین شده است .

تیترهای HI به عنوان میانگین هندسی در مقیاس log2 با بالاترین رقت بیان می شوند که به طور کامل از جمع شدن گلبول های قرمز خون

برای نمونه های سرمی به دست آمده هر گروه جلوگیری می کند.

مقادیر OD492 نانومتر درروش HI با میانگین سه آزمایش مستقل به روش دانکن به دست آمد

و اعداد مختلف از لحاظ آماری اختلاف قابل توجهی را در P <0/01نشان می دهند.

تلاش های زیادی برای توسعه(پرورش) مواد تشکیل دهنده واکسن های گیاهی انجام شده است

که بیان کننده گلیکوپروتئین های HNو F ازNDV است که قبلا ذکر شد.

در مطالعه فوق تولید یک گلیکوپروتئین مولتی مریک HN-F جدید از NDV در بذر کلزا با استفاده از پروموتر FAE

مخصوص دانه گزارش می دهیم. در آنالیز ساترن بلات(Southern blot)  اکثر مجموع وقایع  تنها یک نسخه ترانس ژن را نشان داد.

(تصویرc.1)این  ترکیب مناسب می تواند ترانس ژن ها را در جایگاه رونویسی که از نظر رونویسی فعال هستند ،

معکوس کند که به نوبه خود منجر به تجمع بالای پروتئین در گیاهان ترانس ژن (تراریخته) می شود.

به علاوه بیشتر وقایع یکپارچه تک نسخه ای ، پروتئین خارجی را به روشی ثابت و قابل پیش بینی بیان می کنند

در حالی که درج ژن های چندگانه(ترکیبی) می تواند باعث خاموش شدن ژن شود درنتیجه بیان ترانس ژن (تراریخته)را مهار می کند.(۴۶)

بیشتر مطالعات گزارش داده اند که تولید گیاهان تراریخته با تعداد نسخه کم

در روش ترانسفورماسیون که درآن  تحویل بر پایه ی آگروباکتریوم کارایی و بیان ژنی بهتری نسبت به حالت بایولیستیک(biolistic) ارائه می دهد.

(۴۷) (حالت biolistic برپایه ی تحویل مستقیم DNA درون سلول های گیاهی با استفاده از قسمت هایی طلا و تنگستن می باشد)

پروتئین مصنوعی HN-F تقریبا ۰/۱۸% ازTSP در بذرهای تحت پروموتر کنترل FAE و ۰/۱۱% در برگهای کلزا تراریخته تحت کنترل ترکیب ویروسی مبتنی بر پروموترCaMV35S جمع شده است.

مطالعه قبلی که از پروموتر FAE استفاده شده برای بیان پروتئین فیوژن باکتریایی در دانه های تراریخته کلزا تا۰/۲۵% از

TSP حاصل شده است.(۳۲)آزمایش های مختلف نشان می دهد که میزان بیان گلیکوپروتئین های HNوF در گونه های

مختلف گیاهی از جمله ذرت (TSP2%) ،تنباکو (TSP0/07%) متغیر بوده است.

(۲۵) سیب زمینی(TSP0/05%) (22-48)

و سانتلا(گیاه بشقابی)(TSP0/35%) (45) عملکرد تولید گلیکوپروتئین های HN-F با استفاده ازپروموتر CaMV35S با بیان مطالعات مقایسه ای گیاهان دیگر در سازش است.

این سطوح بیان عمدتا تحت آزمایش  پروموتر یوبی کوئیتین در ذرت و CaMV35S در گونه های دیگر می باشد.سطح بیان تا حدودی پایین بود اما براساس مطالعه روی چالش این سطوح برای

ایمنی زایی کافی است.

(۴)یافته های ما نشان می دهد که سطح بیان به دست آمده توسط پروموتر تنظیم کننده FAE

مختص بذر که قادر به ایجادپاسخ ایمنی کافی در مرغ های خوراکی است.

آنالیز وسترن بلات :

ما قادر به شناسایی یک باند حدود ۷۵کیلودالتونی با استفاده از آنتی بادی های ضد کلونال مختص HN و F بودیم که کمی

بالاتر از پروتئین اصلی HN-F (69 کیلودالتون)  قرار داشت.(تصویر ۳a,b)این نتیجه مشابه پروتئین فیوژن NDV بیان شده در گیاهان ذرت تراریخته بود.(۲۴)علاوه بر این،لکه های ایجاد شده توسط آنتی بادی های مختص  ضد HNو F نشان می دهد

که HN-F مصنوعی به عنوان پروتئین سالم و منحصر به فرد با ماندگاری اپی توپ های اصلی در دانه کلزا بیان می شود.

به طور قابل پیش بینی، توالی پروتئینHN-Fدارای برخی از سایتهای N-گلیکولیزاسیون  بالقوه است که ممکن است منجر

به این شود که اختلاف کمی در وزن مولکولی این پروتئین توسط آنزیم های گلیکولیزاسیون گیاهی گلیکوزیله می شود.

نشان داده شده است که پروتئین های نوترکیب توسط گیاهان در حین حمل و نقل ازER به دستگاه گلژی گلیکوزیله شده اند

و به وسیله برخی ازبقایای کربوهیدرات پس از ترجمه به عنوان N-گلیکولیزاسیون متصل شده اند.(۵۱-۵۰)

 

نتایج  ELIZA  نشان داد که آنتی‌بادی‌های IgG در سرم مرغ‌ها،

پس از ۲۸ روز از ایمنی‌سازی با مواد گیاهی تراریخته و تیتراسیون آنتی‌بادی‌ها تولید شدند و به بالاترین سطح خود در روز ۳۴_۴۹ رسیدند.همچنین،روش مشابهی برای تحریک

پاسخ ایمنی همورال در دو رویکرد یعنی به صورت خوراکی و مکمل خوراکی با  یک دوز قوی‌تر rHN_F خالص‌شده باکتریایی

در مقایسه با واکسن تجاری،مشاهده شده بود.مشخص شده است

که ایمنی همورال نقش مهمی در محافظت دربرابر عفونتNDV دارد.

اگرچه آنتی‌بادی‌ها تنظیم‌کننده‌های(مدولاتورها) ذاتی حفاظت هستند،

اما سهم ایمنی‌سلولی در پاکسازی ویروس از طریق نابود‌کردن مستقیم سلول‌های آلوده به NDV از ملاحظات مهم در برابرچالش میدانی (عملی)‌ است.نتایج

ما در مورد مصرف خوراکی گلیکوپروتئین HN_F با سایر یافته‌ها مطابقت دارد.

برای مثال پروتئین F متعلق بهNDV در ذرت،

آنتی‌ژن HN از NDV در توتون و پروتئین VP2  در بیماری بورس(مایع بین دو بافت) عفونی توسط یک ویروس در برنج منتقل شد.

علاوه‌ براین، تشخیص سطح نسبتا بالایی از آنتی‌بادی‌های HI  با استفاده از تست HI ،

گواهی‌ می‌داد که دانه‌های اصلاح‌شده‌ی کلزا ، بیان ‌کننده HN_F نوترکیب هستند.

این پروتئین قدرت تحریک یک واکنش ایمونولوژیکال را در جو‌جه‌های واکسینه شده به عنوان یک واکسن کاربردی چه از راه خوراکی و چه از طریق تزریق دهانی دارد.

اثر تست HI :

گرچه تست HI لزوما نشان‌دهنده‌ی آنتی‌بادی‌های موثر و خنثی‌کننده نیست،

اما به عنوان یک شاخص عالی جهت ارزیابی حفاظت و پاسخ ایمنی پس از واکسیناسیون علیه NDV استفاده می‌‌شود.

استخراج سطح مطلوبی از آنتی‌بادی‌ها در تست ELISA و HI ،

به علت مناطق بسیار آنتی‌ژنیک و اپی‌توپ‌های خنثی‌کننده‌ی گلیکوپروتئین‌های F و HN در ساختار مصنوعی HN_F انتظار می‌رفت.

مشخص شده‌است که واکسن‌های نوترکیب گیاهی شامل مقداری N_گلیکان مثل B_1,2_xylose و a_1,3_fucose هستند

که این اجزا در گلیکوپروتئین‌های پستانداران و پرندگان پیدا نشده است.

گرچه ممکن است آن‌ها،واکنش‌های نامطلوب احتمالی ایجاد کنند،

هیچ گزارشی مبنی بر تاثیر آنتی‌ژن‌های گلیکوزیله شده‌یNDV  روی عملکرد N _ گلیکان به عنوان یک ایمونوژن در جوجه‌ها وجود ندارد.

به علت ارتباط مستقیم بین حفاظت و سطح آنتی‌بادی‌ها،

به نظر می‌رسد که قرار دادن این اپی‌توپ‌های ایمونوژنیک از گلیکوپروتئین‌های HN و F در محل‌های موردنظر،

یک کنفورماسیون فضایی از پروتئین کایمریک برای رساندن به سیستم ایمنی پرندگان فراهم می‌کند.

 

نتیجه گیری

مطالعات نشان داده که پروتئین F-HN چند زیرواحدی تولید شده در دانه های کلزا تراریخته شده

پس از واکسیناسیون ایمنی زایی خود را در جوجه ها حفظ می کند که این موصوع گامی در جهت پیشرفت های علمی می باشد .

مثلا پلت فرم( الحاق(اتصال) اولئوزین ) برای بیان واکسن های گیاهی به عنوان یک واکسن مشابه بیولوژیکی با قیمت ارزان معرفی می شود .

با این حال برای ارزیابی اثر واکسیناسیون خوراکی علاوه بر آزمایش های تأیید شده مانند

چالش با سویه NDV که پرخطرنیزمی باشد به مطالعات بیشتری احتیاج است .

علاوه بر این ، ما معتقدیم که باید آزمایشات بیشتری برای تعیین امکان فنی و اقتصادی اجرای واکسن های مبتنی بر

بذر درصنعت طیور انجام شود.

ما از موسسه تحقیقات واکسن و سرم رازی

(RVSRI (بخاطر فراهم آوردن شرایط ویژه برای نگهداری مرغ های SPF و کمک به انجام واکسیناسیون سپاسگزار هستیم.

بودجه این تحقیق تا حدودی توسط Grant شماره ۴۴۷ و ۹۷۰۵۱۷-۷۰۲-IV

از موسسه ملی مهندسی ژنتیک وبیوتکنولوژی (NIGEB(و انستیتوی ملی توسعه تحقیقات پزشکی (NIMAD (به شماره ۹۶۴۷۹۶ تأمین شد.

انطباق با استاندارد های اخلاقی :

تمام مراحل انجام شده در این آزمایش که مربوط به حیوانات می باشد مطابق با استاندارها اخلاقی است.

 

ویراستاری:علیرضا صدیق / کارشناسی بیوتکنولوژی.

منابع تصاویر : zootecnicainternational / farmcenta

0 پاسخ

دیدگاه خود را ثبت کنید

تمایل دارید در گفتگوها شرکت کنید؟
در گفتگو ها شرکت کنید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *